如何識別DNA質粒製劑中的超級線圈、刻痕和圓形

我最喜歡和學生一起做的一件事是讓他們在瓊脂糖凝膠上運行質粒DNA。我讓他們測試兩個樣本:未切割的質粒DNA，和用限製性內切酶線性化的質粒DNA。

我喜歡讓他們試著弄清楚未切割質粒DNA的條帶模式(為什麼你看到2-3條帶?)和線性化DNA的單條帶(為什麼線性化後所有條帶都轉化為1條帶?)

我喜歡這個練習，因為理解凝膠上的形式需要理解DNA的本質。

在這篇文章中，我將重點介紹在凝膠上觀察到的四種最常見的未切割質粒DNA，以及如何識別它們。

在下一篇文章中，我將介紹如何增加恢複所需的超卷物種．

一個分子，多種形式:為什麼瓊脂糖凝膠上未切割的質粒DNA有3個條帶

當未切割的質粒DNA被分離出來並在瓊脂糖凝膠上運行時，你可能會觀察到兩條、三條、甚至四條或更多條帶。希望你分離出來的大部分DNA都是超盤繞的，但其他形式的DNA也會突然出現。這些表格將如何顯示在計算機上瓊脂糖凝膠(以相對遷移速度計算)如下圖所示:

在這裏，我將帶你們了解每種形式的來源。

超螺旋質粒

超螺旋DNA是發現的原生DNA構象在活的有機體內當額外的扭曲被引入雙螺旋鏈時就會發生。人們經常把DNA的形式比作橡皮筋或電話線(我知道你們中的一些人一定還記得帶線的電話!)如果你過度擰橡皮筋或電話線，線圈就會堆積在一起，產生張力。

在DNA質粒製劑的情況下，這種超螺旋張力不能被緩解，因為質粒的兩端是連接在一起的。由於其構象，超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速度比預測的要快。超螺旋DNA是分離質粒DNA的理想物種。

缺口質粒、鬆弛質粒或圓形質粒

在超螺旋形態中發現的DNA不容易被複製機製獲取。在複製過程中，細胞拓撲異構酶劃破DNA螺旋的一條鏈並放鬆超螺旋張力，從而允許聚合酶獲得DNA。用橡皮筋來比喻，帶缺口的圓形DNA就是沒有任何扭曲的橡皮筋。這個大的軟綿綿的圓圈是瓊脂糖凝膠中遷移最慢的形式。

線性的質粒

當DNA螺旋在同一位置被切斷時，線性化DNA就發生了。線性DNA通常在缺口圓形和超螺旋形式之間遷移。然而，它也可以遷移相同的距離作為缺口的圓圈-它遷移由DNA的長度預測(相對於分子量標記)。

通過將未切割的質粒DNA與使用限製性內切酶線性化的質粒樣本進行比較，可以識別瓊脂糖凝膠上的線性DNA形式。如果你在希望得到超螺旋DNA(例如在DNA質粒準備後)時得到線性DNA，這是由於核酸酶汙染或純化過程中的嚴厲處理。

圓形，單鏈質粒

在堿性裂解質粒製備過程中，質粒變性，因為氫鍵被堿性條件破壞。但是共價閉合的圓鏈仍然保持完整，並在拓撲上受到約束pH值還原為中性，氫鍵重組，超螺旋DNA重新形成。

然而，如果堿性溶菌作用如果步驟過於苛刻(例如，孵育時間過長)，DNA可能會永久變性，並產生無用的單鏈封閉圈，這些單鏈封閉圈會先於凝膠中所有其他形式的質粒遷移。

成功製備DNA質粒

雖然DNA質粒預處理可以返回多種形式的DNA，但要成功克隆和轉染，隻需要一種:超螺旋。確保你知道如何增加你的收入高質量超螺旋DNA的恢複．這是否幫助你理解為什麼在瓊脂糖凝膠上運行質粒DNA時會得到三條條帶?你還有其他準備質粒的技巧嗎?我們很樂意在評論中聽到。

最初發表於2014年10月8日。2021年4月審查並重新發表。