實驗室基礎知識:堿性裂解如何工作

堿性裂解法於1979年由Birnboim和Doly首次提出，並經過一些修改，成為從細菌中提取質粒DNA的首選方法描述堿性裂解如何工作的最簡單的方法是通過程序和解釋每一步，所以這裏。

一步一步的指導堿性裂解

第一步:細胞生長和收獲

首先是攜帶質粒的細菌細胞培養物的生長。當達到足夠的生長時，細胞被離心成球，從生長介質中除去。

第二步:再懸浮

然後將顆粒重新懸浮在含有Tris、EDTA、葡萄糖和RNase a的溶液中(通常稱為溶液1，或試劑盒中的類似溶液)。

二價陽離子(毫克^{2 +}、鈣^{2 +})是dna酶活性和細菌細胞壁完整性所必需的。

EDTA螯合溶液中的二價陽離子，防止dna酶破壞質粒，也有助於破壞細胞壁的穩定。

葡萄糖維持著滲透壓，所以細胞不會破裂當細胞被裂解時，RNase A會被包括進來降解細胞RNA。

第三步:堿性裂解

裂解緩衝液(又稱溶液2)含有氫氧化鈉(NaOH)和洗滌劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。

SDS使細胞膜增溶。

氫氧化鈉有助於破壞細胞壁，但更重要的是，它破壞了DNA堿基之間的氫鍵，將細胞中的雙鏈DNA (dsDNA)，包括基因組DNA (gDNA)和質粒，轉化為單鏈DNA (ssDNA)。

這個過程被稱為變性，是過程的核心部分，這就是為什麼它被稱為堿性裂解。

SDS還使細胞中的大部分蛋白質變性，這有助於在後期從質粒中分離蛋白質。

在這一步驟中，重要的是要確保再懸浮和裂解緩衝液很好地混合，但不要太劇烈(見下文)。看看我的相關文章基因克隆載體製備的5個技巧獲取更多信息和提示。此外，請記住，SDS和NaOH是非常討厭的，所以在進行堿性裂解時，建議戴手套和眼睛保護裝置。

步驟4:中和

乙酸鉀(溶液3)的加入降低了混合物的堿度。在這種條件下，單鏈DNA的堿基之間的氫鍵可以重新建立，因此ssDNA可以重新性質為dsDNA。這是選擇性的部分。

雖然小的圓形質粒DNA很容易重新自然，但不可能適當退火那些巨大的gDNA延伸。這就是為什麼在裂解過程中要溫和的原因，因為劇烈的混合或渦旋會剪切gDNA，產生更短的延伸可以重新退火和汙染你的質粒準備。

雖然雙鏈質粒容易溶解在溶液中，但單鏈基因組DNA、SDS和變性細胞蛋白通過疏水相互作用粘在一起，形成白色沉澱。通過離心可以很容易地將沉澱從質粒DNA溶液中分離出來。

第五步:清洗和集中注意力

現在，你的質粒DNA已經從大部分的細胞碎片中分離出來了，但它是在一個含有大量鹽、EDTA、RNase、殘留的細胞蛋白質和碎片的溶液中，所以它對下遊應用沒有太多用處。下一步是清理溶液並濃縮質粒DNA。

有幾種方法可以做到這一點，包括苯酚/氯仿提取，然後乙醇沉澱和親和層析法，在一定的鹽或條件下優先與質粒DNA結合pH值，但在其他條件下釋放。文章中詳細介紹了最常用的方法清理DNA樣本的5種方法．

那麼，你多久使用一次堿性裂解來製備質粒?讓我們知道，在評論部分，任何酷的技巧和技巧，你用得到更好和更快的結果!

參考文獻

1. Birnboim H.C.和多利J。一種快速堿性提取重組質粒DNA的方法。核酸的研究,1979;7(6): 1513 - 23所示。

最初發表於2014年10月8日。2021年6月評審並重新發表。