更準確地測量蛋白質濃度

當處理蛋白質時，一個好的分析方法的關鍵部分是通過測量蛋白質濃度來準確地確定你有多少蛋白質。

為什麼準確的蛋白質定量很重要?

準確測量蛋白質濃度是至關重要的，例如，如果你試圖確定結合常數或測量酶動力學;但即使你做的是更定性的事情，對你有多少蛋白質有一個很好的概念，這將使你能夠比較從一個實驗到下一個實驗的結果，從一個蛋白質到下一個。

有幾種測量蛋白質濃度的方法，每種方法都有自己的優點和缺點，那麼如何知道哪種方法適合你的蛋白質呢?在本文中，我們將討論三種不同的測量蛋白質濃度的方法:280 nm吸光度法、Bradford法和BCA法。

3測定蛋白質濃度的主要方法

1.280 nm處吸光度

它是如何工作的

芳香殘基，如酪氨酸和色氨酸，吸收280納米的紫外線。因此，如果你有蛋白質的消光係數(e)，你可以用紫外/可見光譜儀測量吸光度，並使用比爾-朗伯定律(也稱為比爾定律)計算蛋白質的濃度:

A = varepsilon lc

地點:

一個= 280的吸光度

varepsilon=摩爾消光係數

l=光譜儀路徑長度

c=蛋白質的摩爾濃度

估計蛋白質的摩爾消光係數

您可以根據使用的序列估計蛋白質的消光係數Expasy的ProtParam工具．

因為ProtParam隻考慮你的蛋白質的線性序列，而不考慮結構，這可能會影響消光係數，你會想要變性你的蛋白質在你測量吸光度。我喜歡在6m胍中變性蛋白質。

優勢

這種測量蛋白質濃度的技術非常快速，而且不需要任何特殊試劑，除了胍，你手邊可能就有。

缺點

這種方法依賴於你的蛋白質有一個準確的消光係數。的消光係數取決於你的蛋白質中芳香殘基的數量．如果沒有相當數量的芳香殘留物，消光係數將非常低，並且您需要相當濃縮的樣品來獲得合理的吸光度(通常吸光度在0.1和1.0之間被認為在“線性範圍”內)。

此外，ProtParam警告說，如果你的蛋白質中沒有色氨酸，那麼消光係數可能至少有10%的誤差。因此，如果你的消光係數很低，如果序列中沒有色氨酸就很可能出現這種情況，10%的誤差可能會嚴重影響你對最終蛋白質濃度的評估。

布拉德福德化驗

它是如何工作的：

布拉德福德法是一種比色法基於考馬斯亮藍(你知道的，就是你用來染凝膠的東西)和蛋白質中的精氨酸和芳香殘基之間的相互作用。當染料與這些殘基結合時，其最大吸收從470nm轉移到595nm。

通常，您測量一係列已知濃度的標準蛋白(通常是牛血清白蛋白(BSA))的吸光度，並創建標準曲線。然後使用該標準曲線根據吸光度計算蛋白質樣品的濃度。

優勢

這種測定方法快速，而且試劑不受DTT和DTT等還原劑的影響β-巰基乙醇，可能在你的緩衝液中。

缺點

基本條件和洗滌劑，如SDS，會幹擾染料與蛋白質結合的能力;然而，有洗滌劑兼容的布拉德福德試劑。

此外，就像280納米技術的吸光度一樣，布拉德福德測定法取決於你的蛋白質序列。如果你的蛋白質不含有相當數量的精氨酸和/或芳香殘基，那麼染料就不能有效地與蛋白質結合，導致蛋白質濃度被低估．

最後，這項技術依賴於比較你的蛋白質和標準蛋白質的吸光度。所以，如果你的蛋白質與染料的反應方式與標準蛋白質不同，你的濃度就會出現問題。

Bicinchoninic Acid (BCA)測定

它是如何工作的

BCA測定法是另一種比色測定法，與布拉德福德測定法類似。它利用雙縮脲反應，其中蛋白質主鏈與銅螯合^２＋並將它們還原成Cu^{1 +}離子。

的銅^{1 +}然後，離子與BCA反應，形成紫色的產物，吸收562納米。該過程與布拉德福德測定法類似，在布拉德福德測定法中，您根據一係列已知的蛋白質標準創建標準曲線。

優勢

由於多肽主鏈參與了反應，BCA測定受蛋白質氨基酸組成差異的影響較小。然而，該反應受到半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基的影響。

該試劑對洗滌劑和變性劑不敏感，所以在緩衝液中有這些是可以的。

缺點

緩衝液中還原劑的存在會幹擾染料，但也有與還原劑相容的染料可用。

反應需要一些時間來進行。通常，樣品在37°C下孵育15-30分鍾。同樣，在Bradford試驗中，您通過從已知的標準蛋白質創建標準曲線來確定蛋白質濃度。所以，如果你的蛋白質不像標準蛋白質那樣與染料相互作用，你的濃度就會出現問題。

蛋白質濃度測定技術的比較

表1比較了3種主要技術，包括它們的主要優點和缺點。

表1:蛋白質濃度測定方法的比較

所以，當你選擇一種測量蛋白質濃度的技術時，有一些事情需要考慮。

為你的蛋白質選擇正確的技術需要一些試驗和錯誤，但是在你的口袋裏有一個好的技術來準確地測量你的蛋白質濃度將節省你大量的時間和精力，並幫助你得到更多可重複的結果。

你最喜歡的方式是什麼測量蛋白質濃度？

最初發表於2011年11月。審查和更新2021年10月。