DNA結紮:它是如何工作的和6個小貼士

在實驗室裏了解最常用的分子生物學技術背後的基本(和簡單的)化學知識不僅能增強你對科學的理解;它會幫助你得到更好的結果。往下讀，你會得到一篇關於DNA連接基礎知識的簡短入門，以及一些優化DNA連接反應的方便提示。

起作用的酶:DNA連接酶

DNA連接酶(電子商務6.5.1.1)是DNA連接反應的核心酶。簡單地說，DNA連接酶將兩個DNA連接在一起!或者，更科學地說，DNA連接酶以鈍的或共價連接DNA的磷酸主鏈兼容的結束(見圖1)。

在生物體中，DNA連接酶是一種重要的酶，在DNA複製和修複中起著關鍵作用——特別是修複DNA分子中的雙鏈斷裂。

DNA連接在實驗室中用於克隆和非克隆應用。DNA連接用於非克隆應用的一個例子包括構建下一代DNA測序文庫。這些過程使用DNA連接酶將專門的適配器連接到DNA片段的兩端，以便進行後續的測序。

對於克隆應用，DNA連接酶通常用於插入限製性內切酶產生的DNA片段到載體骨幹。商用連接酶提供含有ATP和Mg的反應緩衝液^{2 +}兩者都是連接酶活性所必需的。

DNA連接反應的兩個步驟

DNA連接反應本身有兩個基本步驟:

1. 首先，DNA末端必須偶然碰撞，並在一起停留足夠長的時間，以便連接酶連接它們。
2. 第二步是酶促反應，如圖所示圖2．DNA連接酶催化3 ' -OH與5 ' -磷酸的結合，通過兩步機製。
   首先，與酶活性位點賴氨酸殘基相連的AMP核苷酸被轉移到5 ' -磷酸基上。
   然後AMP -磷酸鹽鍵被3 ' -OH攻擊，形成共價鍵並釋放AMP。為了讓酶進行進一步的反應，ATP必須補充酶活性位點上的AMP。

優化克隆DNA連接反應的6個技巧

DNA結紮可能令人沮喪。有時它們沒有明顯的原因就不能工作。

我們的6大DNA結紮提示將提高您的結紮效率，並有望提高您的克隆成功率!

1.降低溫度

DNA連接反應的第二部分是反應中效率最低的部分，但在低溫下更容易完成。

為什麼?你可能知道，所有的分子在高溫下運動得更快，所以你可以想象，如果兩個DNA末端在低溫下輕輕漂浮在溶液中而不是在高溫下快速移動，它們會更容易碰撞並停留在一起。

有內聚的結局還有一個額外的原因。較低的溫度穩定了互補核苷酸之間的氫鍵，這真的有助於保持物質的原位。

DNA連接酶在25°C時具有最佳活性，因此連接反應在最佳溫度(1°C)和酶反應(25°C)之間進行。

通常在16°C下1小時就可以了，但由於將DNA末端聚集在一起是反應效率最低的部分，因此將溫度降低到4°C可以提供更高的效率。然而，酶在這種溫度下工作非常緩慢，因此需要很長時間(如一夜)的孵育時間。

2.對齊連接酶緩衝

連接酶緩衝液中的ATP是DNA連接反應所必需的，但可以通過反複的凍融循環而被分解。為了避免這種情況，從每個新的DNA連接酶庫存中提取連接酶緩衝液。

使混合料足夠小，可以一次性使用(例如，5 μ L)，並確保在混合前完全解凍和混合好。

3.在結紮前加熱DNA

當建立內聚端連接時，首先混合載體和插入片段，加熱到65°C 5分鍾，然後添加剩餘的反應組分。

這個加熱步驟中斷了任何矢量/矢量或插入/插入內聚端相互作用，否則可能會幹擾所需的矢量/插入相互作用，降低了連接效率。

4.檢查pH值

DNA結紮的最佳pH值範圍為7.6 ~ 8.0。根據DNA片段的製備方式，結紮混合物的pH值可能在這個範圍之外。

您可以通過將約0.2 μ L的混合物移液到窄pH範圍的紙上(例如pH 6-8)來檢查結紮混合物的pH值。如果需要，用0.2µL滴2M Tris堿或1M HCl調節pH。

5.包括聚乙二醇(PEG)

與任何化學反應一樣，反應組分的濃度可以極大地影響結紮反應的速度。PEG是一種疏水分子，在反應中占據空間，有效地增加了水反應組分的濃度，如DNA、ATP和連接酶。

將聚乙二醇(如聚乙二醇8000)添加到最終濃度的5-15%可提高結紮效率。記住，聚乙二醇濃度超過5%會降低轉化效率。此外，熱失活或長時間培養含有PEG的結紮反應也會降低轉化效率。

6.在轉化前添加限製性內切酶

這個巧妙的技巧可以用來避免因未消化的向量而產生的高背景。如果向量片段刪除在準備性消化過程中含有一個獨特的限製性內切位點，在連接反應中添加相應的限製性內切酶將選擇性地消化任何完整的載體，防止其轉化。

在轉化前5-10分鍾添加1µL酶就足夠了。

DNA結紮了

希望我們已經展示了DNA連接反應的最佳條件是DNA分子相互作用和酶連接反應之間的微妙平衡。我們希望這些信息和我們的頂級提示能幫助您成功結紮。

想了解更多關於DNA結紮的知識嗎?發現為什麼T4 DNA連接酶就是這樣一種流行的連接酶也許這是你唯一需要的結紮酶。

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最初發表於2007年10月31日;更新和轉載2022年5月．