免費PCR 5年(或如何自己製作Taq而且空斑形成單位聚合酶)

世界各地的實驗室在商業製造上花費了大量的資金Taq聚合酶鏈反應。但你不必這麼做:許多實驗室為了節省開支，選擇自己製作Taq(和Pfu)用於日常應用。

這篇文章並不打算提供一個循序漸進的協議，讓你自己做Taq聚合酶(盡管下麵提供了此類協議的鏈接)。相反，我想建議你可以考慮這樣做，為你的實驗室節省一些錢。我還將提供一些從多年經驗和各種來源中積累的一般技巧，如果您決定這樣做，可能會使這個過程更容易一些。

現在，很明顯，你不能製造所有基於pcr的應用都需要的聚合酶。許多技術，如基於pcr的克隆和位點定向誘變，需要高保真度或高度加工的聚合酶，這些技術仍在有效專利中覆蓋，並不能廣泛獲得。然而，如果你的實驗室做了很多基因分型或其他基於pcr的技術，不需要高保真或加工，自製Taq也許是正確的選擇。

它不僅製作成本低廉(幾乎像“免費PCR”一樣)，而且製作大量的聚合酶也很容易:單一的、相對簡單的準備可以很容易地在每升培養液中產生數十萬單位的高度純化聚合酶。換句話說，一批酶可以為10-12人的實驗室提供足夠使用數年的酶(如果儲存得當的話)。

自製的小貼士和建議Taq聚合酶

1. 那麼你需要一個質粒．不要有Taq表達質粒?沒有問題。學術研究人員可以獲得含有水生棲熱菌（Taq)聚合酶在這裏,海床憤怒（空斑形成單位)聚合酶在這裏．
2. 獲得高收益。在提純之前將質粒轉化為細菌，而不是依賴於甘油儲備;這將大大提高你的產量。
3. 保持穩定。添加NP-40你的淨化溶液似乎能提高酶的穩定性。
4. (非常)容易去除不需要的蛋白質．用簡單的熱處理(75°C)去除細菌蛋白質汙染-大多數細菌蛋白質會變性和沉澱，而Taq(由於其高熱穩定性)將保持可溶性。
5. 小心沉澱。滴定用於沉澱酶的聚乙烯亞胺(PEI)的量，因為所需的濃度是可變的，添加太多會抑製沉澱。
6. 調整最終濃度。同樣，總是滴定最終酶的濃度。太多的酶會幹擾你的下遊PCR應用。
7. 妥善保存。透析後，將純化的酶儲存在-80°C的50%甘油中(50-100 μ l等份)-它可以穩定多年。工作庫存可以保持在-20°C幾個月。
8. 對抗蛋白酶。添加牛血清白蛋白(BSA)(最終濃度為100µg/mL)將有助於抵消準備中可能的蛋白酶汙染，有助於穩定酶並保持其活性。

製作自己的Taq聚合酶的規程

• Engelke等(1990)純化在大腸杆菌中表達的水生熱菌DNA聚合酶。學生物化學肛門。191(2): 396 - 400。描述Taq克隆的早期論文，包括純化細節。
• Farralli等(2007)在生物實驗室製作Taq DNA聚合酶．Bios78(2): 69 - 74。描述了一種適用於本科教學實驗室的Taq淨化方法。如果你隻是想為自己的實驗室做更小的準備，也很好。
• Moazen等(2012)Taq DNA聚合酶在大腸杆菌中的表達優化．Adv Biomed Res。1:82。改進Taq淨化的最新報告。
• pTAQ質粒信息．基於Web的資源與許多細節Taq，包括一個完整的淨化協議。
• [生物101]Taq DNA聚合酶的製備．另一個基於網絡的Taq淨化的協議。

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最初發布於2013年3月27日。2015年3月12日更新並重新發布