熒光素酶報告實驗:如何工作
熒光素酶報告基因檢測是研究轉錄水平基因表達的常用手段。由於它方便、相對便宜、能立即給出定量測量結果，因此被廣泛使用。
它在細胞和分子生物學的各個領域都有廣泛的應用——無論你想測量或跟蹤克隆基因的表達．
與許多分析和試劑盒一樣，許多使用熒光素酶報告分析的人沒有花時間完全了解它的工作原理。但是，了解你所使用的基本技巧是必要的，當你遇到問題時排除故障，並說服你的論文考官你知道你在說什麼!
所以讓我們深入研究熒光素酶實驗的內部工作原理。
熒光素酶報告基因實驗的核心反應
熒光素酶是氧化酶的一種，在許多物種中都有發現，它們能使生物體發出“生物熒光”或發光。其中最著名的一種酶是螢火蟲熒光素酶。螢火蟲可以通過熒光素酶將熒光素轉化為氧化熒光素的化學反應發光。這個反應釋放的一些能量以光的形式存在。
這個反應的能量效率很高，這意味著幾乎所有投入反應的能量都迅速轉化為光。這使得它非常敏感，這是一個偉大的報告分析!
有趣的是……生物發光在自然界中有各種不同的用途．其中一些功能包括交流、尋找交配對象、尋找食物、偽裝和自衛。在昆蟲中，它被認為在解氧方麵發揮著額外的作用，這一功能可能是最近才進化出來的。但我離題了，回到實驗上來…
進行化驗
市麵上有幾種熒光素酶報告基因檢測試劑盒，包括包含熒光素酶報告基因(或其變體)的表達載體和反應發生所需的試劑。
要進行報告基因分析，需要在這些表達載體中克隆熒光素酶基因上遊的感興趣基因(X)的調控區，將產生的載體DNA導入細胞，並讓細胞生長一段時間以允許轉錄和翻譯發生。
然後收集細胞，打開它們釋放所有的蛋白質(包括熒光素酶)，加入熒光素和所有必要的輔助因子，使用發光儀(一種測量樣品發光並給出定量讀數的儀器)測量酶的活性。
由於X控製著熒光素酶報告基因的表達，因此熒光素酶活性與X的活性可以直接相關。
熒光素酶檢測告訴你什麼信息?
熒光素酶報告基因分析使您可以研究一個感興趣的基因的調控控製。光的存在意味著熒光素酶被轉錄，因此調控區域是活躍的。這可以讓你確定一個特定的蛋白質是否參與了你感興趣的基因的表達，或者你感興趣的基因的調控區域是否在某些條件下是活躍的。
熒光素酶作為報告劑的缺點
雖然熒光素酶報告基因檢測有一些巨大的好處，但它也有一些缺點:
- 細胞通常需要被裂解才能定量轉錄(盡管有一些方法可以測量活細胞中的熒光素酶活性)。
- 熒光素酶需要ATP來轉化底物。這意味著細胞的代謝狀態會影響結果，並為結果引入偏差然而，你可以使用不依賴atp的熒光素酶來克服這個問題。
- 漏失的啟動子有時會導致背景信號的增加，但已經產生了不穩定的報告子，它們會迅速降解以幫助克服這個問題。
利用熒光素酶研究基因表達的好處
- 該報告分析可用於研究基因表達以及參與基因調控的其他細胞成分和事件。
- 其極高的靈敏度允許對轉錄中的微小變化進行量化，而且在完成實驗的幾分鍾內就能得到結果，這使其更具吸引力。
- 與熒光報告相比，熒光素酶具有較低的背景信號。
總而言之，熒光素酶報告試驗可能正是你需要為你的項目提供一些光線的東西!
最初發布於2013年8月26日。審查和更新，2021年9月。
參考文獻
- Hakkila K,等．報告基因lucFF、luxCDABE、gfp和dsred在全細胞細菌傳感器中具有不同的特征．肛交。生物化學》2002。301;235 - 242。
除了上述複雜因素外，請記住，隨著熒光素酶消耗糖酵解產生的所有能量，而不是丙酮酸，細胞的氧化還原電位增加。細胞氧化還原電位的升高對全球代謝通路具有不可預測的影響。
這是如何量化的，而不是合格的?如果熒光素酶存在(即轉錄和翻譯)，它會不會繼續與遊離熒光素反應，直到所有的熒光素反應完畢?
“它的極端敏感性允許對轉錄中的微小變化進行量化”……所以，你在這裏測量的是轉錄還是翻譯?因為實際上，熒光素酶蛋白質會產生光信號。如果你的GOI隻是被轉錄而不是在蛋白質水平上表達，你就不會得到信號，對吧?
我認為它實際上測量了轉錄，因為你要做的是插入熒光素酶基因，它是一種蛋白質，它會幫助熒光素的轉化。
所以光越多，就有越多的熒光素，這意味著有很多熒光素酶被轉錄(當然，它被翻譯成蛋白質來獲得它的功能)，所以更多的熒光素酶轉錄意味著更多的基因轉錄。要理解這一點，你需要了解基因是如何構成的。假設你正在研究β -冰川糖苷酶基因，1-首先有b-冰川糖苷酶的啟動子，2-熒光素酶基因，3-剩下的b-半乳糖糖苷酶基因。
你把事情搞得太複雜了。轉錄和翻譯都是必要的。
熒光素酶基因- >(轉錄)- >熒光素酶轉錄- >(翻譯)- >熒光素酶
熒光素酶轉錄本- >(測定)- >無發光
翻譯後的熒光素酶- >(測定)- >發光*
對稱的聲音吧!
我猜熒光素酶翻譯是必要的測量。然而，這並不意味著你感興趣的基因已經被翻譯成蛋白質(隻是它的啟動子更活躍或更活躍)。
要獲得熒光素酶催化反應，除了轉錄外，當然還需要翻譯。
然而，我們感興趣的變量可能是轉錄，這是基於這樣的假設:在給定相同數量的轉錄本來增加蛋白質的情況下，轉錄本的增加導致蛋白質的增加，而不是翻譯機製生產的特定增加。我甚至不確定後者是否可行。
我的實驗室研究的是轉錄後的基因調控，我們將miRNA結合位點放在了熒光素酶基因的3’UTR上，檢測miRNA結合的效果和酶的活性。我們基本上比較了報告基因有和沒有miRNA結合位點的效果。所以這兩種結構都有相同的啟動子酶活性的差異必須是在翻譯水平上。因此，在這種情況下，感興趣的變量既可以在轉錄水平上，也可以在翻譯水平上。