PCR的曆史

就像青黴素、微波爐和培樂多泥等科學上的一些偉大發現一樣，聚合酶鏈反應也是偶然發現的。多虧了許多科學家的工作，包括沃森和克裏克、科恩伯格、霍拉納、克萊諾、克萊佩(那麼多K……)和桑格，到1980年，PCR的所有主要成分都被描述出來了。就像黃油、麵粉、雞蛋和糖排列在廚房桌子上一樣，聚合酶鏈反應的原料正等著有人大喊“蛋糕!”，並為科學界打開了一種具有無數應用的技術。

聚合酶鏈反應之父

在Cetus公司工作的Kary B. Mullis (Ks的另一分!)因其在PCR方麵的工作獲得了1993年的諾貝爾化學獎(與Michael Smith一起)，並因其發明而獲得認可。就像許多後來被證明非常重要的偉大發明和發現一樣，科學界對聚合酶鏈反應產生興趣需要時間。

當穆利斯在一次會議上展示了早期的PCR配方及其背後的思考過程時，沒有人能想象出最終的產品。在他人生的最低穀，穆利斯的職業生涯幾乎脫軌，因為他為自己的想法辯護，在會議上引發了一場爭吵，他被免去了寡核苷酸合成實驗室主任的職務。科學會拒絕他關於聚合酶鏈反應的論文，隻是為了說出它的名字Taq三年後，聚合酶被評為“年度分子”。

由於與埃利希實驗室的合作，PCR項目重新回到了正軌，在接下來的幾年裏，它得到了完善，各種應用得到了發展，包括DNA指紋識別(1986年)、基因擴增係統(1988年)、溴化乙胺實時PCR(1992年)和基因組測序(2001年)。

PCR的概念

穆利斯從小就對化學感興趣，當時他和朋友們喜歡幾個小時地炸東西。在聽了一個關於DNA合成和基因克隆的研討會後，他意識到化學可以用來製造DNA，他的興奮使他成功地申請了Cetus合成寡核苷酸的職位。

穆利斯的隔壁是亨利·埃利希實驗室，他們試圖開發檢測遺傳物質中點突變的方法。埃利希實驗室設計了一種被稱為低聚物限製的技術，並成為導致PCR的基本思想。標記的寡核苷酸探針與互補的目標序列雜交，然後使用限製性內切酶裂解二聚體。然而，如果序列與探針不完全匹配，限製酶就不能識別序列並將其裂解。然而，這種技術存在許多問題，在考慮解決方案時，Mullis在1983年提出了PCR的概念。

低聚物的限製

低聚物限製隻能應用於改變已知核酸序列酶限製的DNA多態性，這意味著它不能用於任何突變。此外，為了檢測到裂解產物，需要有多個副本。因此，為了對更多質粒使用寡聚物限製，需要擴增目標序列以增加與目標位點的結合。序列必須非常獨特，否則探針將與DNA沿線的數百甚至數千個位點結合。

Mullis最終想出了一個主意:在大量存在四種核苷三磷酸和引物的情況下，可以使用多輪複製，並使用第二種寡核苷酸探針來檢測目標序列的互補鏈，而不是單輪複製。這將消除對限製性內切酶的需要，因此，隻要為其製作了特定的引物，任何序列都可以使用。由於在連續的每一輪複製中，目標序列產物的數量會增加，最終遠遠超過任何汙染序列的數量，因此不需要一個具有豐富目標序列的更純淨的起始樣本。由於目標序列可以被設定為特定長度，因此它們可以作為限製性內切片段在凝膠上被檢測到，因此非特異性結合或與不感興趣的序列結合不會影響結果。

首次PCR運行

當穆利斯第一次嚐試聚合酶鏈反應時，他希望不需要溫度循環，這些成分可以自己照顧自己。幾次沒有明顯產物的實驗向他展示了他最害怕的事情:必須重新調整溫度，使反應從單鏈DNA溫度循環到雙鏈DNA溫度，而且由於當時使用的聚合酶熱不穩定，需要在30輪的每一輪中添加新的酶，以產生幾乎純的產物。

令人痛苦的是，溫度必須用手來控製。這意味著將反應加熱到95°C，然後讓它冷卻，加入DNA聚合酶，然後將溫度加熱30倍以上。因此，這是一項費時、費力、乏味的工作。想象一下解決引物結合的最佳溫度問題?你不需要把你的培養皿放入PCR循環儀中，給不同的行不同的退火溫度，而是需要手工處理每個樣本，每30-60秒從一個浴池移動到另一個浴池。當時，樣品並不是在方便的96孔板上采集的，而是在試管中，所以你可以想象，幾個小時的工作將從一個水浴池跑到另一個水浴池，計時器不停地響個不停。

發明了熱循環器

到1985年和1987年，溫度穩定Taq在Cetus和Perkin-Elmer合資後，聚合酶和第一台PCR機器PCR-1000熱循環儀開始商用。這些都有助於降低成本和時間花費在執行這項技術，並開辟了許多新的應用，為其商業用途和在研究中使用。

許多人可以追溯到遺傳學之父格雷戈·孟德爾，甚至更早的時候，他們都在發現PCR的過程中發揮了作用。當我們現在在進行PCR時可以喝杯咖啡時，它曾經是一項極其緩慢和勞動密集型的技術。在2-3小時內，我們就能合成幾乎純的遺傳物質，其中包含10億份目標序列的拷貝，最繁重的勞動由機器完成。我們所有人都應該感激我們不是早期做PCR的可憐的研究生!