實驗室基礎知識:堿性裂解是如何工作的

1979年，Birnboim和Doly首次描述了堿性裂解法，經過一些修改後，一直是從細菌中提取質粒DNA的首選方法描述堿性裂解如何工作的最簡單的方法是通過整個過程並解釋每個步驟，所以這裏。

堿性裂解的一步一步指南

步驟1:細胞生長和收獲

你從攜帶質粒的細菌細胞培養開始。當達到足夠的生長時，用離心將細胞造粒，從生長培養基中去除。

第二步:再懸浮

然後將顆粒重懸在含有Tris、EDTA、葡萄糖和RNase a的溶液(通常稱為溶液1，或類似的試劑盒)中。

二價陽離子(毫克^{2 +}、鈣^{2 +})是DNase活性和細菌細胞壁完整性所必需的。

EDTA螯合溶液中的二價陽離子，防止dna酶破壞質粒，也有助於破壞細胞壁。

葡萄糖維持滲透壓，因此細胞不會破裂，RNase A被包括在細胞裂解時降解細胞RNA。

第三步:堿性裂解

裂解緩衝液(aka solution 2)包含氫氧化鈉(NaOH)和洗滌劑十二烷基硫酸鈉(十二烷基)(SDS)。

SDS可溶解細胞膜。

氫氧化鈉有助於分解細胞壁，但更重要的是，它破壞了DNA堿基之間的氫鍵，將細胞中的雙鏈DNA (dsDNA)，包括基因組DNA (gDNA)和質粒轉化為單鏈DNA (ssDNA)。

這個過程被稱為變性，是這個過程的核心部分，這就是為什麼它被稱為堿性裂解。

SDS也使細胞中的大多數蛋白質變性，這有助於在這個過程的後期將蛋白質從質粒中分離出來。

在這一步驟中，重要的是要確保再懸浮緩衝液和裂解緩衝液混合得很好，盡管不能太強烈(見下文)。查看我的相關文章基因克隆載體製備的5個提示了解更多信息和技巧。此外，記住SDS和NaOH是非常討厭的，所以建議在進行堿性裂解時戴手套和眼睛保護。

步驟4:中和

醋酸鉀(溶液3)的加入降低了混合物的堿度。在這些條件下，單鏈DNA的堿基之間的氫鍵可以重新建立，所以ssDNA可以重新性質為dsDNA。這是選擇性的部分。

雖然小的圓形質粒DNA很容易重新自然，但要對那些巨大的gDNA片段進行適當的退火是不可能的。這就是為什麼在裂解過程中保持溫和是很重要的，因為劇烈的混合或渦流會剪切gDNA，使其拉長更短可以重新退火並汙染你的質粒預備。

雖然雙鏈質粒容易溶解在溶液中，但單鏈基因組DNA、SDS和變性細胞蛋白通過疏水相互作用粘在一起，形成白色沉澱。沉澱物可以很容易地從質粒DNA溶液中分離出來。

第五步:清潔和集中注意力

現在你的質粒DNA已經從大部分細胞碎片中分離出來了，但它是在一個含有大量鹽，EDTA, RNase，以及殘留的細胞蛋白質和碎片的溶液中，所以它對下遊應用沒有太大用處。下一步是清理溶液並濃縮質粒DNA。

有幾種方法可以做到這一點，包括苯酚/氯仿提取，然後乙醇沉澱和基於親和層析的方法，使用支持劑，在一定的鹽或pH條件下優先結合質粒DNA，但在其他條件下釋放它。本文詳細介紹了最常用的方法5種清理DNA樣本的方法．

那麼，你多久使用堿性裂解質粒準備?請在評論部分告訴我們，你可以使用任何很酷的技巧來獲得更好更快的結果!

參考文獻

1. Birnboim H.C.和Doly J。一種快速堿性提取重組質粒DNA的方法。核酸的研究,1979;7(6): 1513 - 23所示。

最初發表於2014年10月8日。2021年6月審查並再版。