下一代測序(NGS)技術初學者指南

2003年人類基因組計劃的完成，開啟了一個快速、廉價、準確的基因組分析的新時代——被稱為下一代測序(NGS)。NGS建立在“第一代測序”技術的基礎上，以產生準確和具有成本效益的測序結果。

1977年，弗雷德·桑格對噬菌體X174病毒進行了第一次DNA全基因組測序。同年，桑格開發了基因組時代的未來支柱:DNA測序技術。他的技術使用了鏈終止法。這被視為基因組測序的“第一代技術”。

由於桑格測序(或鏈終止法)是第一代測序技術因此，理解它是非常重要的。人類基因組計劃始於桑格測序技術。

桑格測序法

Sanger測序方法依賴於雙脫氧核苷酸(ddNTPs)，是一種脫氧核苷三磷酸(dNTPs)，它缺乏3 '羥基，而是有一個氫原子。當這些堿基與不斷增長的DNA序列結合時，它們就會終止複製，因為它們不能與其他堿基結合。要進行桑格測序，將引物添加到含有待測序基因信息的溶液中，然後將溶液分成4個PCR反應。每個反應都包含一個與ddNTP混合的ddNTP，其中一個核苷酸被ddNTP取代(a, T, G和C ddNTP基團)。在聚合酶鏈反應的最後，每一個反應都會產生不同長度的聚合酶鏈反應產物，因為複製是隨機終止的。通過在有4個通道的凝膠上運行樣本，你可以將每個序列拚湊在一起，因為每個序列都是從相同的原始材料複製而來的。此處以“ddntp”為例，“dntp”為非“ddntp”。

你的序列是ATGCTCAG。

你的四種反應是:
與ddATP的反應:一個, ATGCTC一個, ATGCTCAG
與ddGTP反應:ATG, ATGCTCAG
與ddCTP反應:ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
與ddTTP的反應:AT, ATGCT,ATGCTCAG

凝膠中所有的反應都是這樣的(圖片來源:Olwen Reina):

每個波段表示不同長度的代碼。例如，樂隊是右邊下麵的“A”象征序列:“ATGCTC一個”

仍然困惑嗎?

讓我們想象一個聚會遊戲。這個遊戲是猜謎遊戲。遊戲規則如下:

你在想一個數字，小組成員必須猜出來。棘手的部分是這個數字的長度是200位。你在腦子裏念著數字，卻沒有發出聲音。經常有人打斷你，你就告訴他們你剛才在想的個位數，以及它在200的數列中的位置。每次你被打斷，你必須重新開始。你幾個小時後離開，小組成員必須找出200位數字。他們必須把你給他們的信息拚湊起來，比如25^th數字是5,40^thNumber是0，以此類推。利用他們打斷的信息，他們可以重複他們給你的數字。

雖然這聽起來像是世界上最蹩腳的遊戲，但它非常適合測序!

不幸的是，它是緩慢的，昂貴的，並且(以前)依賴於放射性材料。這促使科學家們開發出新的、更好的基因組測序方式。

新一代測序技術

基因組測序的最大進步是速度和準確性的提高，從而減少了人力和成本。這種速度得益於並行分析和高通量技術。這就像讓一個4歲的孩子讀《白鯨記》和讓一群戲劇專業的學生每人讀一段然後讓他們立刻讀一樣。

自從桑格發明了他的方法以來，測序機已經有了很大的改進。1987年，應用生物係統公司(Applied Biosystems)率先推出了一種名為AB370的自動測序機。這種機器依賴於一種叫做毛細管電泳的方法，這種方法使用了桑格鏈終止法，而不需要凝膠。

將熒光標記的終止鏈的ddntp添加到PCR反應混合物中。通過Sanger測序法，生成不同長度的PCR產物，然後根據其大小進行分離。大小由PCR產物的總負電荷來衡量。負電荷越多，碎片就越長。以上麵的ddNTP合並示例為例，想象一下大膽的字母是帶有熒光染料的ddntp。當這些片段被拉向毛細管的正極(見下圖)時，它們通過一束激光束，觸發附著在ddNTP上的熒光色素發出的閃光，這是堿基類型的特征(例如，綠色代表a，黃色代表T，藍色代表G，紅色代表C)。這樣，基因組就被仔細讀取。

最大的不同在於速度和成本。通過並行分析和高通量設置，AB370可以一次檢測96個堿基，每天檢測500K個堿基，讀取長度為600個堿基。這種形式的測序成為完成人類基因組計劃的主要工具。

NGS與第一代測序相比如何?

NGS的特點是提高了精度和速度，但也減少了人力和成本。基因組測序從來沒有像現在這樣便宜、方便或直接。可以說，最大的改進是並行分析的發展，這提高了測序速度。

現在唯一讓我們慢下來的是對結果的解釋!