尋找尼莫:理解單細胞分離和PCR擴增

每一種單細胞PCR方法都可以分為兩個步驟。在第一步中，通過顯微操作、激光捕獲顯微解剖、流式細胞術或直接微量移液分離細胞。接下來，基因物質被聚合酶鏈反應處理以擴增你感興趣的序列。

在這裏，我們將通過不同的選擇隔離你的細胞。

注意:AmpliGrid是一個玻璃幻燈片大小的收集器，這將使你的單細胞隔離不那麼令人頭疼。它允許您檢查您的細胞是否已成功轉移，從而提高整體結果。然而，激光顯微解剖仍然很耗時。雖然這種芯片實驗室技術允許你在非常低的容量下處理48個樣本，但你需要一個特殊的PCR機器來使用它們。

任務1:挖掘寶藏——如何隔離你的細胞

精密控製

應用程序:法醫學、生殖醫學和細菌細胞分析。

這是經過時間檢驗的處理單個單元格的標準方法。該設備由連接到倒置顯微鏡的操縱杆組成。操縱杆控製顯微鏡的平台。

缺點:雖然這種方法功能強大，但速度也很慢，而且存在質量問題。前一個問題是由於將細胞從懸浮的培養基轉移到試管或微量滴度板所需的時間。當微操作器離開可以觀察樣品的光學平麵後，不可能從視覺上確保每個單細胞都已正確地轉移到管或井的底部。這就導致了PCR擴增後下遊的問題，因為陰性結果不能最終被說成是陰性;可能隻是沒有添加單元格。這個問題可以通過使用AmpliGrid來解決。

激光捕獲顯微解剖(LCM)

這個方法比其他方法快。感興趣的細胞可以從組織、生物體、細胞塗片、染色體製劑、石蠟或冷凍嵌入樣品和小細胞集合中分離出來。在使用顯微鏡手動、半自動或自動選擇組織後，用激光切割預定義的組織切片。這有點像一個抓娃娃機撿起一個玩具(雖然在成功地給你你想要的東西方麵要好得多!)激光切割寬度不超過1 μ m，因此活細胞不會被激光切割損傷，可用於克隆和培養。

缺點:這種技術的硬件是昂貴的，處理細胞的速度與組織學家觀察樣本的經驗有很大關係。

流式細胞術

就速度而言，這個家夥獲得了獎章，大約每分鍾分類100萬個細胞。它可以處理不同數量的免疫參數，這取決於機器，但8是標準的。將電池放入井中的成功率一般(從50%到70%不等)，因為在電池到達井底之前，板上的電荷會引起電池的偏轉。使用AmpliGrid幻燈片可以大大改善這一點。正確的放置可以在之後用熒光顯微鏡驗證。這讓你在分析PCR結果時安心，因為你不需要懷疑陰性結果是否由於細胞放置不當。

從培養皿中移液

這種方法把你帶回到你的微型吸管，跳過了中間環節，因為你直接從培養物中對細胞進行分類。使用CellSorter軟件，您可以自己查看您的樣本或讓軟件為您這樣做。該軟件可以自動檢測熒光細胞。這個程序會生成一張地圖，告訴你它們在哪裏，以及如何最好地找到它們。使用玻璃微量吸管，你可以選擇你感興趣的細胞，或者，這可以自動為你完成。在一次運行中可以拾取多達1000個細胞。速度取決於你是拾取一個cell(20-24秒/cell)還是多個cell (1 cell/秒)。這種技術在技術上具有挑戰性，當然也比其他方法慢，但它可以讓你實時判斷你的細胞是否已經到達了應該為你節省時間的地方，以便在隨後的篩選井中結束大量的空白需要處理。

任務2:言歸正傳——放大你細胞的遺傳物質

首先通過細胞裂解提取你的遺傳物質。接下來，使用任意一個PCR形式最適合你的實驗。如果使用AmpliGrid，您將需要一個AmpliSpeed幻燈片循環器。最常用的兩個選項是:

• rt - pcr:r逆向transcriptase在PCR過程中用於將RNA轉化為互補DNA (cDNA)。如果你有一個RNA樣本需要被放大，這是被使用的。
• qPCR:問定量PCR允許您使用熒光染料或DNA探針實時測量您感興趣的基因在樣品中的數量。

哪種單細胞隔離方法最適合你?