不要有憂鬱:讓Lac Operon為你工作

葡萄糖是最佳的食物來源大腸杆菌,然而，當葡萄糖水平下降時，大腸杆菌需要尋找其他方式來養活自己。其中一種方法是用乳糖代謝取代葡萄糖代謝。

乳糖代謝的誘導和控製是一個複雜的過程，分子生物學家已經對其進行了不同類型的實驗。例如,蟲膠操縱子可用於控製基因表達。此外,基因的蟲膠操縱子可以用來將感興趣的蛋白質帶到特定的核酸片段中．

在本文中，我們將看看如何蟲膠操縱子可用於細菌重組質粒的篩選。要理解這個故事，你需要知道兩個重要的方麵蟲膠操縱子。

謝謝你讚美補充

的蟲膠操縱子是為消化乳糖的蛋白質編碼的一組基因大腸杆菌還有一些其他的腸道細菌。我在第一篇文章中詳細解釋了它的工作原理。

重要的基因蟲膠為了今天的目的，我們需要了解的操縱子是lacZ基因，它編碼β-半乳糖苷酶(或者更親切地稱為β-gal)。

β-gal酶在乳糖消化中發揮作用，將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。在活性狀態下，酶以同型四聚體的形式存在;四個相同的部件相互聯係在一起。早期，一種突變的β-gal酶來自於大腸杆菌被發現缺少一堆n端殘基。缺少了這部分蛋白質，酶就無法形成四聚體，因此酶處於非活性狀態。

這種突變形式被稱為ω肽，而缺失的片段被稱為α肽。

令人驚訝的是，我們發現酶的活性是通過提供反式中的α-肽而恢複的，即不與蛋白質相連。因此，在缺失的片段存在的情況下，酶的工作過程被稱為α-互補。記住這個想法。

故事中的另一個參與者:IPTG

像異丙基-β- d -硫代半乳糖，誘導蟲膠操縱子轉錄。IPTG與lac阻遏劑結合，使其無法抑製蟲膠操縱子。與他化乳糖不同，IPTG不被β-半乳糖苷酶消化所以IPTG水平保持不變蟲膠操縱子的表達不波動，而是以可預測的速率發生。這意味著當你增加IPTG的濃度時，蟲膠操縱子的表達將增加，直到達到峰值和高原。

IPTG誘導和藍/白篩選

所以你將插入的DNA克隆到一個載體上並將其轉化為細菌。每個產生的菌落都應該包含重組質粒，對嗎?不幸的是，這不是真的，我們可以使用各種工具來幫助我們確定哪些菌落包含我們感興趣的質粒。

藍/白篩選是最早用於幫助識別包含重組質粒的細菌菌落的工具之一。

我在這裏!

想象一下，你是一名州考官，你正在試圖找出哪些學生已經收到了一份試卷。最快的方法不是逐個檢查每個學生;而是要求每個還沒有舉手的人舉手，實際上是在喊“我願意!”

藍/白屏幕正是這樣做的!嗯,不完全是本身．當被鍍到適當的培養基(Xgal)上時，已經吸收了含有你感興趣的基因的重組質粒的菌落仍然是無色的，而那些沒有變成藍色的。如果當你問學生“是”或“否”的問題時，細菌可以舉起小手說“不”，那就太酷了。

他們如何舉手

藍/白篩選通過破壞α-互補發揮作用。

在藍/白屏中，使用主機大腸杆菌含有突變體的菌株lacZω-肽(即β-gal非活性)基因編碼。你將要使用的質粒在編碼α-肽的序列中包含多個克隆位點。如果你正確地將你感興趣的序列插入到多個克隆位點，你的序列將中斷α-肽的表達。

在轉換為大腸杆菌，不包含插入物的質粒將提供α-肽，活性β-gal將被表達。含有插入物的質粒不會提供α-肽，β-gal將保持活性。

活性β-gal可用X-gal檢測。X-gal是一種無色的乳糖類似物(又名乳糖類似物)，它被β-gal分解，形成明亮的藍色色素。如果你把細菌放在含有X-gal的瓊脂上，那麼任何藍色菌落都有活性β-gal，但沒有插入物。你可以更有信心地收集白色菌落，因為這些細菌含有插入的質粒。

不要忘記IPTG!

盡管這個係統聽起來很棒，但有時宿主細胞產生的β-gal不足以使蜂群變藍。這對你沒有好處，因為你最終會撿到一堆無用的細菌。

為了避免這個問題，大多數人還在瓊脂中加入IPTG。IPTG將緩解蟲膠操縱子，確保突變β-gal酶的高表達。

這就是擺脫克隆憂鬱的方法。