熱不對稱交錯PCR (TAIL-PCR)

兔子、硬幣和PCR有什麼共同之處?他們都有尾巴!(哈哈!)

熱不對稱交錯PCR或TAIL-PCR用於測序和分析與已知序列相鄰的未知DNA片段。你可以把它看作是一種社交。你知道你想了解某人，所以你讓一個共同的朋友介紹你認識。這項技術對於發現基因的調控序列和識別大型基因組標記群體中的插入位點非常有用。

TAIL-PCR使用“嵌套”或“特定”引物。這些引物之所以不叫這個名字，是因為它們傾向於棲息在相互纏繞的樹枝上，它們隻是普通的引物，但這確實給人一種相當奇怪的印象。

在正常PCR中，除非引物非常特異性，否則非目標序列的非特異性結合和擴增是很有可能的(即使是熱啟動PCR)。嵌套引物拯救!這些引物在兩個“正常”引物的序列內結合，因此舒適地“築巢”。這給了他們更好的歧視權力。

那麼bunn- TAIL-PCR是怎麼工作的呢?

TAIL-PCR從PCR的熱循環和一對相對較遠的引物開始。接下來，添加一個額外的引物或一對引物(我們嵌套的朋友)，它們在第一組引物之間綁定序列，也稱為“外部”，“任意簡並”(AD)或“邊界”引物。它們比外部引物添加的濃度更高，因此在幾個循環後，它們占據主導地位，比其他引物產生更多的PCR產物。當我們想要繪製轉移DNA插入基因組的位置時，這項技術就會派上用場。

兩種引物的退火溫度不同。PCR程序在嵌套的引物偏愛的反應(或“次級反應”)之間包含間歇的外部引物偏愛的偏愛循環(稱為“初級反應”)。這使得序列的一端有特定引物，另一端有AD引物。然後使用另一組嵌套引物在隨後的幾輪PCR(稱為“三級反應”)中擴增產物序列。

等等，什麼是AD引物我們為什麼要加他們?!

AD引物與已知序列緊密結合。通過使用這些不那麼挑剔的引物，可以增加包含目標序列的序列數量，從而減少非目標結合的數量。當有小的突變時，超級特殊的引物不太可能結合但這些家夥有點遲鈍，也不能分辨出區別。

不太複雜吧!

現在已經解釋了概念，讓我們進入細節。

在你搜索TAIL-PCR的簡單解釋時，你可能經常看到“嚴格性”這個詞，並對自己說“說什麼?”

每次你看到這個詞，就想想溫度。高嚴格度意味著使用更高的溫度(63°C)。高嚴格周期生成特定的綁定事件。也使用低或中等嚴格度(44°C)和低嚴格度(30°C)。較低的嚴格度與較不挑剔的結合有關，而較高的嚴格度與較特定的引物有關。

三種特異性引物用於PCR的三個階段，第一階段、第二階段和第三階段。這些是正常的PCR引物，在60°C下進行，長度大約是20-35個核苷酸。使用一個AD引物，長度為8-12個核苷酸，在約45°C下跳、跳和跳。所有引物都與它們的反向引物一起使用。

但是我們的嵌套朋友在哪裏呢?

所使用的特定引物由末端引物(用於初級階段)和兩個嵌套引物(用於次級和第三階段)組成。AD引物將與相鄰的未知序列結合，特定引物將與已知序列結合。

PCR計劃的實質是這樣的:

類別	每個細菌細胞的典型拷貝數
低拷貝(例如pBR22及其衍生品)	每個細胞拷貝15-20份
媒介複製	每個細胞拷貝20-100份
高拷貝(如pUC18, pUC19載體)	每個細胞500-700份拷貝

二次反應:這裏使用了其中一個嵌套引物和AD引物對。這裏使用了10-15個tails事件。這將產生適量的未知感興趣序列(由於減少了嚴格周期)，但AD和特定引物一起產生大量的特定產物。再次，產物被稀釋1000倍，並作為第三反應的成分。一次反應:使用末端引物對(正向和反向序列)和AD引物對。使用五個嚴格循環，然後是一個減少的嚴格循環。接下來是尾隨階段。這包括兩個高嚴格循環，然後是一個降低嚴格循環，重複10-12次。這就產生了三個產物。首先，我們已知的由末端特異性引物複製的序列在高嚴格度階段產生，並大量產生。 Secondly, reduced stringency cycles favouring AD primer binding to various parts of the unknown sequence of interest and is made in moderate amounts. Thirdly, a product is made from AD primers binding the product of high stringency cycles during reduced stringency cycles but this is in very small amounts. These products are diluted 1000–fold and serve as the templates for the secondary reaction.

第三反應:使用第二個嵌套引物和AD引物，同樣隻使用tails事件。這會產生大量你想要的產品和可忽略不計的非特異性產品。

耶!

產品可以用瓊脂糖凝膠電泳第三反應後，可洗脫，並用於進一步的過程，如克隆和測序。