向限製性內切酶和連接酶說再見:序列和連接酶獨立克隆(SLIC)簡介

SLIC，即序列和連接酶獨立克隆，是李在2007年開發的發表在自然的方法。是什麼讓它成為自然方法有價值的協議嗎?與其他形式的克隆不同，SLIC不需要限製性內切酶或連接酶!

認真對待!

不相信我?為什麼不自己試試呢?我在下麵詳細介紹了讓您開始的主要步驟。

它是如何工作的

要使用SLIC進行克隆，首先要用聚合酶鏈反應。您使用特殊設計的寡核苷酸進行PCR，其5 '端有25個堿基對序列，與您想要克隆的載體(“目的載體”)的末端同源。載體的“末端”將是你想要插入PCR產物的DNA的任意一側。

其次，通過線性化向量來創建你想要的“端點”。你可以通過限製性內切酶消化，或者對那些想要完全不含限製性內切酶的人來說，可以用PCR擴增。

第三，在沒有dNTPs的情況下，用T4噬菌體DNA聚合酶分別處理PCR產物和線性化載體。聚合酶將利用其3 '外切酶活性，從載體和PCR產物的3 '端開始，形成懸垂物。

由於寡核苷酸的設計，線性化的目的載體和PCR產物都包含一個同源區域。懸垂物創造了載體和PCR產物，這是天作之合!或者在試管裏…

在線性化載體和PCR產物的末端有足夠長的互補的5 '單鏈懸垂物暴露後，將dCTP加入反應中。dCTP的加入觸發了T4 DNA聚合酶的聚合酶活性。然而，由於反應混合物中隻有四分之一的dNTPs存在，複製是最小的，因此懸垂得以維持。

他們在神聖的婚姻中結合在一起您看!你得到了含有片段的向量。然而，這在質粒環上留下了一些空隙。

但是不要害怕!

當你把質粒轉化成大腸杆菌細胞的間隙被修複了。

您也可以使用混合或不完全PCR產物來顯示懸垂物。要做到這一點，你將咬碎的載體和PCR產物混合並退火在一起，以創建一個具有四個單鏈缺口或空間的質粒。

SLIC可能很狡猾

如果你現在渴望開始使用SLIC，有幾個要點你需要知道。像每一種技術一樣，它也有一些缺點，我在下麵列出了它們。

DNA序列的末端不能有任何花哨的二級結構，如環或發夾，像那些在終止序列。這些結構將與相鄰組裝片段的單鏈退火/引物競爭。從好的方麵來看，這個問題可以通過將相鄰片段的序列添加到序列的麻煩末端來解決。

重複序列也是成功組裝的一個問題，因為組裝是由序列同源性指導的。如果兩個不同的程序集片段在一端相同，則可能形成不完整或不正確的程序集。為了避免程序集片段不兼容，通常需要執行順序的分層程序集，以免在同一反應中同時放置具有相同終端的程序集片段。或者，您可以用具有相同函數的不相同序列對替換重複序列。

此外，如果序列多樣性發生在待組裝序列片段末端的15個堿基對內，則組合SLIC(其中您與另一種類型的連接酶獨立克隆方法(如SLICE)相結合)並不是理想的，因為這會防止在所有組合中重複使用相同的同源序列。然而，如果所有組合和組裝連接中的序列恒等式足夠廣泛而不是限製，則可以使用組合SLIC。

你要跟限製酶和連接酶說再見了嗎?

參考文獻

• 李，MZ和SJ Elledge (2007)利用同源重組在體外通過SLIC生成重組DNA。自然的方法。4: 251 - 6。