放開你的連接酶:轉移PCR

當我買了一件新毛衣時，我喜歡發現它能搭配幾條褲子，一條顏色很尷尬的圍巾，還有我還沒戴的耳環。聚合酶鏈反應就像這件毛衣，它幾乎可以與任何東西搭配，分子生物學正在充分利用這一點，利用每一個機會。

自PCR首次商業化以來，已有數十種變體被創造出來，以滿足不同學科科學家的需求。

不久前，我們觀察了超過20種不同類型的PCR．然而，這個列表並不詳盡，另一個已經出現在我們的雷達上:轉移pcr，更廣為人知的說法是TPCR。

什麼是轉移PCR

TPCR是一種從載體中擴增目標DNA並將其整合到目的載體中的方法，無需使用連接酶。你可以同時在一個蛋白質編碼基因中引入多個目標突變，而沒有時間延遲!嗯,好吃。

Erijman等人的TPCR作為一種靈活，快速，廉價的連接酶獨立平台，用於重組DNA克隆和多位點靶向突變。

既然有幾種不依賴連接酶的克隆協議存在，人們不得不問，是什麼讓TPCR有任何不同?

• 放大和整合步驟都發生在同一根管中
• 你可以將你的片段克隆到目標載體上的一個位置，而不需要淨化步驟來去除中間的PCR產物。

讓我們來看看你開始需要什麼。

DNA克隆:在這期間發生了什麼?

讓我們通過協議中的三個步驟來分解實際發生的事情:

• PCR擴增(第一步)
• 中間階段(步驟2)
• 將你的基因片段合並到目標載體中(步驟3)

1 .放大

將供體質粒(綠色)和目的質粒(紅色)加入引物、dNTPS、鹽、純水和所有其他常用PCR成分的湯中。引物與靶基因3 '端和目的載體整合位點對應的序列互補。引物中也應存在與目的載體5 '端整合位點相對應的序列。在原論文中使用了兩個長度為500bp和1300bp的靶基因。

第二步:中間階段

與純化反應和去除中間PCR產物(紅色和綠色線)不同的是，由於3 '端互補，這些產物可作為大型引物加入線性擴增的目的載體中。因為你的目標片段沒有這種互補性，所以它們不能完成這個功能。

用12個循環的有限擴增來擴增目的基因。在此之後，我們有第二個PCR反應20步，包括更長的延伸時間，以使您的大型引物被納入目標載體。這種情況發生的效率主要取決於所用引物的濃度，可能需要一些故障排除才能得到正確的結果，但總的原則是引物濃度與中間PCR產物的較高產量相關，這是我們需要實現的。不幸的是，當引物濃度過高時，插入基因進入目標載體的幾率就會降低所以這是一個平衡的過程。

第三步:晚餐時間

含有目標基因的受體質粒被DpnI(粉色pacmans)去除甲基化的供體質粒。然後將反應混合物轉化為大腸杆菌細胞獲得新形成的重組質粒。

菌落聚合酶鏈反應可以確保你得到最純淨的產品!如果你真的需要安慰，你也可以用DNA測序。

注意:同樣的方法也可以用於產生帶有一些小變化的點突變-請參閱本文定點誘變欲了解更多信息

設計引物

用於產生點突變的更改

TPCR最適合用於製造目標突變體的組合文庫，但你也可以用它在整個目標基因中製造具有特定多個突變的變體。

在步驟1中，將包含所需突變的引物一起使用。位於兩端的遠端引物中的一個必須處於相反的方向。步驟2的產物可能有不同的長度，不會是您所希望的突變片段的純混合物。PCR產物通過全質粒擴增納入供體質粒，取代野生型序列。步驟3與上述步驟3相同，但最終產物是由各種突變質粒組合組成的組合庫。

非常直接和方便!

你試過TPCR嗎?

來源:

Erijman一，唐太斯一個，Bernheim R，Shifman JM，法勒Y(2011)轉移pcr (Transfer-PCR, TPCR): DNA克隆和蛋白質工程的高速公路．結構生物學175:171 - 177。

Erijman, A.等人(2014)使用轉移pcr (TPCR)平台的單管DNA組裝．方法Mol Biol1116: 89 - 101。