六個方法來衡量T細胞反應

描述T細胞可能是有問題的，因為它們有各種各樣的亞型，因為研究膜結合T細胞受體的技術困難，但在某些情況下，你希望能夠做到這一點，如分析免疫記憶被誘導的程度，以衡量個體對特定抗原的反應有多好。

如果你真的想研究T細胞的反應，不要害怕!實現這一目標的方法多種多樣，而這些檢測方法主要分為兩大類:一類是通過測量特定的反應(如細胞因子分泌)來檢測T細胞對刺激的反應激活，另一類是通過T細胞受體的特異性來分析細胞。

1.限製稀釋文化

這項技術包括通過使用不同稀釋度的細胞來測量對特定抗原產生反應的T細胞的頻率，然後測量沒有反應的T細胞孔的數量。

我不想深入討論太多數學問題，但簡而言之，每個孔中活性T細胞的分布應該遵循泊鬆分布(因為這些細胞應該是隨機分布的)。我們可以利用這些信息來計算我們有多少活躍的T細胞。

簡而言之，我們從泊鬆分布得知，如果反應為陰性的孔的比例為37%，那麼平均每個孔有一個抗原特異性T細胞。

因此，讀取產生37%陰性孔的細胞數量，然後我們就可以計算出反應細胞的頻率。例:如果每孔5000個細胞的播種細胞導致37%的細胞為陰性，我們就知道我們有1/5000個活性細胞的頻率。

在啟動或免疫小鼠後，頻率應該增加，表明抗原正在推動增殖。

2.ELISPOT

如果你想進行更詳細的研究，比如表型細胞，有限稀釋培養是相當費力的。在這些情況下，您可以使用ELISPOT(酶聯immunospot)測定。這是ELIZA的變種。使用這種技術，你可以通過細胞因子的產生來測量T細胞的反應。

的步驟:

簡而言之，您在PVDF(聚偏氟乙烯)覆蓋的微板上塗上單克隆或多克隆抗體，然後使用無反應血清進行阻斷，並在板上與一種物質或細胞一起培養T細胞，以激活細胞因子分泌。細胞分裂素然後被包被的抗體捕獲。接下來，在再次清洗之前，先清洗培養皿，清除碎片、未結合的抗體和培養基，然後添加二抗，二抗體與顯色(著色)底物(通常是鏈黴親和素與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)耦合。然後你可以看到你感興趣的細胞因子作為可見的斑點，並分別用顯微鏡或自動使用自動閱讀器手動計數。

這種方法也有它的缺點，雖然它在定量T細胞產生抗體的數量方麵更方便和有用，但在描述單個細胞產生細胞因子的情況時仍然有局限性。但是不要擔心，對於那些想在單細胞水平上進行特征分析的人來說，有細胞內染色!

3.細胞內染色

有一個偉大的細胞內染色的文章它提供了關於這項技術的更多信息，但簡而言之，在固定和滲透細胞之前，你可以通過使用蛋白質轉運抑製劑(如莫能素或Brefeldin)來抑製細胞因子的分泌。然後你可以使用熒光標記的抗體特異性的細胞因子和流式細胞術測量。當然，這種方法也有一個缺點，那就是你的細胞會在這個過程中被殺死。

4.細胞因子捕獲

細胞內染色的另一種選擇也克服了ELISPOT的問題是捕獲細胞因子,它使用混合抗體。在這裏，來自不同抗體的兩個重鏈和輕鏈對被組合成一個混合抗體，該抗體具有兩個針對兩個不同配體的抗原結合位點。這些雙特異性抗體用於檢測細胞因子。一種配體是T細胞特異性的標記物，另一種配體是相關細胞因子特異性的標記物。活化的T細胞用蛋白質轉運抑製劑處理，細胞因子在細胞內積累。

然後使用混合抗體捕獲和檢測T細胞表麵的標記細胞因子。一個混合抗體可以用來做這個。混合抗體由針對相關細胞因子和常見細胞表麵蛋白(如MHC i類)的特異性抗體合成。混合抗體結合激活的T細胞。如果T細胞分泌細胞因子，結合在細胞表麵的混合抗體就會捕獲它們。然後使用針對相關細胞因子的標記第二抗體檢測分泌細胞因子的T細胞。

5.四聚物染色

T細胞的反應也可以通過其受體的特異性來測定fluorochrome-tagged四聚體或特定的MHC:肽複合體。MHC:肽四聚體由重組的MHC分子與生物素-鏈黴親和素結合的特定肽段製成。表達相應特異性的T細胞結合這些四聚體。然後對其進行染色檢測，並可通過流式細胞術進行分析!

6.光譜分析和生物傳感器分析

T細胞群的多樣性可以用spectratyping．這裏，CDR3區域被凝膠電泳可視化，允許你比較表達相同V段的受體。生物傳感器檢測然後可以用來測量配體與它們的互補抗原受體的結合和解離率。

將待測配體固定在鍍金表麵上。然後，可溶性T細胞受體與結合的配體接觸並結合。一段時間後，它們會分離。這種發生的速度可以用生物傳感器實時測量。附著和分離的速率由生物傳感器監測，該傳感器能夠測量分子在鍍金玻璃芯片表麵的結合，通過結合對偏振光源在玻璃芯片表麵的總內部反射的影響。它會檢測到反射光束的角度和強度的任何波動，並根據時間繪製出“傳感器圖”。

受體也可以結合而不是配體。在達到最大綁定後，當係統處於飽和狀態或在綁定和解離之間達到平衡狀態時，圖線將趨於平穩，表明不再發生綁定。然後，未結合的分子就會被衝走，在持續洗滌之後，它們都開始從它們結合的蛋白質上脫落。測量相互作用的曲線將開始下降，顯示出解離發生的速率。

你用什麼方法分析t細胞?