油浸顯微鏡如何提高分辨率
使用油浸顯微鏡可以幫助提高光顯微鏡的分辨率。這反過來又能產生更好的圖像——誰不想要更好的顯微鏡圖像呢?
但是，你知道嗎為什麼浸沒油和物鏡用於高倍數放大?
你知道嗎?如何如何正確使用沉浸感目標?
圖像的質量取決於數值孔徑(NA)和分辨率。NA與顯微鏡光學元件的光收集特性有關，而分辨率是你分辨樣本內部細節的能力。
使用油浸顯微鏡可以提高你的分辨率和NA!
現在讓我們來看看為什麼會這樣。
為什麼你應該使用油浸顯微鏡
折射和折射率的作用
光所穿過的介質或材料的確切物理性質決定了光的衍射量。這就是所謂的“折射率”，和NA一樣沒有單位。
對於非浸入式(或稱為“幹式”)物鏡，物鏡的前鏡頭和封麵的上表麵之間有一個氣隙。大多數顯微鏡載玻片和蓋玻片的折射率為1.5，而空氣的折射率為1.0。
當光從一種介質到另一種介質時，比如從玻璃到空氣，它會發生“折射”或彎曲和散射。因此，如果你使用幹燥的物鏡，來自樣品的光線在從玻璃罩傳播到空氣中時會發生折射。折射光線通常不會被物鏡前鏡收集，而丟失到最終圖像中。
現在，如果你使用浸入式介質來取代氣隙，你可以糾正這種不匹配。大多數商業浸漬油的折射率約為1.51，與玻璃類似。
這就是油浸顯微鏡如何提高你的高功率浸入物鏡的分辨率，並通過降低折射增加你的NA。
目標的工作距離
當您聚焦一個物鏡並將其移近幻燈片或封麵時，焦平麵將進一步移動到您的標本中。然而，在物鏡的鼻尖撞到封麵之前，你能走多遠是有物理限製的。再往前走，你就不會受歡迎了!從冷凝器中清除玻璃碎片是一項費時又昂貴的工作。更不要說你會損壞物鏡前鏡頭!
當一個標本在敏銳聚焦時，物鏡前鏡頭和蓋套表麵之間的實際距離(毫米或微米)被稱為“工作距離”。一般來說，放大倍數與工作距離成反比關係。放大率為10倍的物鏡的工作距離約為4毫米，而100倍的油浸物鏡的工作距離約為130 μ m。你可以找到你的目標工作距離或“WD”刻在你的目標桶(隻是不要混淆它和“水浸”)。
天然和合成浸泡油
雪鬆木油
在大規模生產合成替代品之前，雪鬆木油多年來一直是浸泡油的首選。今天你仍然可以買到雪鬆木的油。然而，這種油有很多缺點。
如果使用後沒有正確清理，它會穿透和破壞固定物鏡前鏡頭的水泥。隨著時間的推移，雪鬆木油也會變黃，並有吸收光譜中紫外線和藍光的傾向。
合成油
現代合成油的設計目的是保持顏色穩定的時間和相對惰性。盡管這並不是使用後不正確清潔的借口!如果您正在進行長期的活細胞成像實驗，需要在細胞和stage周圍的溫度控製室，您必須仔細選擇您的浸泡油。
大多數油在室溫(即23°C)下工作。溫度的變化會引起油的折射率的變化。事實上，僅1°C的溫差就能使油的折射率變化0.0004倍。這可能看起來不多，但如果你拍了好幾個小時的圖像，這些細微的差異就會出現在你收集的圖像和數據中。因此，如果你計劃使用油浸顯微鏡進行這樣的長期實驗，請使用設計在37°C下工作的商業油。
謹防自發熒光
另一點要記住的是，一般使用的油可以自動熒光。當計劃和實施熒光顯微鏡時，你應該使用非熒光油。這些油有字母“F”之前或之後的油代碼或名稱。最後，無論你進行什麼成像，你都應該使用顯微鏡和物鏡製造商推薦的油。
油浸顯微鏡的6個簡單步驟
- 使用低倍率物鏡找到幻燈片感興趣的區域。
- 將目鏡從低倍率移動到40倍物鏡，在每個倍率處停下來對焦，確保當你向下看目鏡時，你感興趣的區域仍然在視野中心。為了正確設置顯微鏡進行克勒照明，我們的另一篇文章，如何用科勒照明將你的圖片從平庸轉變為出版質量”。
- 一旦你對好了顯微鏡，小心地把鏡架轉到40度和油浸物鏡之間，但不要完全使用油浸物鏡。
- 把你的注意力從“目鏡下麵”轉移到“顯微鏡的側麵”。小心地將一滴浸漬油直接滴在封麵上。這是一滴-你不是在給自行車鏈條上油!
- 現在，把鼻片轉過來，完全接觸油浸物鏡，讓你的浸物鏡的鼻子接觸到油滴。一些浸入式物鏡有凹麵鏡頭。如果你使用的是其中之一，你還需要在鏡頭前添加一滴浸泡油，以防止氣泡被困在凹進去的凹槽裏。
- 接下來，向後看目鏡，用隻有精細的對焦控製，慢慢地讓你的標本恢複對焦。雖然浸入式物鏡有彈簧加載的鼻錐，但這並不是一個邀請增加焦點。在這個階段快速對焦很容易導致物鏡龜裂蓋片和滑片。這是一個代價高昂的事故，因為這樣做可能導致玻璃碎片(和油)落入子級冷凝器(或在物鏡和倒置顯微鏡的鼻翼上)，甚至可能損壞浸入物鏡的前鏡頭——顯微鏡中最昂貴的部件之一。所以要有耐心，慢慢集中注意力。
用浸沒物鏡完成成像後，清理油汙。即使你打算在同一個會話中再次使用這個目標，也要清理!浸泡油可以(而且會)穿透顯微鏡部件，損壞“幹燥”的物鏡，因為浸泡油會腐蝕固定物鏡前鏡頭的水泥。
要清潔浸入式物鏡，請使用鏡頭清潔紙巾沿一個方向掃過物鏡前鏡頭的表麵。繼續以同樣的方式清洗(每次清洗都用一塊幹淨的晶狀體組織)，直到在組織上看不到油。你也可以使用商業浸漬除油溶液或少量二甲苯進行最終清潔。一如既往，在使用任何解決方案清潔你的目標之前，檢查製造商的建議。
希望這對你的油浸顯微鏡有幫助，現在你知道為什麼和如何正確使用浸沒物鏡了。使用油浸顯微鏡將有助於提高你的分辨率，反過來，導致更好的圖像!
要了解更多，請查看我們在NA上的其他文章。”另一個數字——顯微術中數值孔徑的意義“關於決議，”摩擦顯微鏡的眼睛:光學分辨率指南”。
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最初發表於2015年3月31日;2022年6月更新並再版．