故障排除RNA隔離

作為廣泛使用,隔離RNA仍然是比較挑剔的協議。隻是執行這項技術的人都有自己的個人技巧成功地分離出完整的RNA樣品與一致性。盡管RNA可以有些不可預測的,因為它是如此的不穩定,有一些可以解決常見的問題。

1。問題:在RNA基因組DNA
RNA與基因組DNA就是明證洗提高分子量塗抹,或凝膠上看起來很幹淨但rt PCR執行時控製放大。

原因:不管你用什麼方法對RNA隔離,DNA的痕跡始終貫徹。這是真的與試劑盒(苯酚)預備和矽旋轉過濾器。這可能是由於剪切基因組DNA在同質化的不足。如果使用苯酚方法,pH值苯酚是關鍵的(應該是酸性)和你的技能在移液水相或多或少會導致DNA汙染。

解決方案:基因組DNA需要均質,所以用這種方法充分休息等DNA高速珠攪拌器或polytron轉子定子。樣品將在均化熱但冷卻樣品導致胍鹽沉澱。所以你需要平衡時間的均化時間冷卻到室溫。

最好的方法去除gDNA DNase治療,如RTS DNase™工具,其中包含一個高活動,室溫穩定DNase,有效地消除了汙染的DNA。DNA切除後,樹脂用於移除DNase酶沒有熱量和EDTA。這種類型的設備是特別推薦樣品富含gDNA(即脾組織),樣品已純化DNase治療之前,當治療部分樣本。“列”方法也可以用於樣品含有低水平的gDNA汙染。

2。問題:降解RNA /低完整性
核糖體rna樂隊出現塗抹凝膠或18比28更加激烈年代樂隊。安捷倫生物分析儀,你看到一個大的18歲的峰值。

原因:退化發生在處理。這很難確定。它可以發生在收集和存儲,或可能在提取。它還可能發生post-isolation。

解決方案:如果問題發生在存儲,確保樣品冷凍後立即集合。使用液態氮或-80°C存儲。動物組織,使用RNALater然後存儲在-20°C。

如果問題發生在提取過程中,嚐試添加beta-mercaptoethanol (BME)裂解緩衝。使用10µl 14.3 M BME每1毫升的裂解緩衝。BME將殺死rna和幫助穩定在提取樣本。

如果樣品是冰箱的防腐劑中提取並不是解決方案,不允許解凍。同質化很快在BME的存在。確保不要留下任何的組織塊。它需要完全溶解。

核糖核酸酶降解隔離後也會發生。確保水用於洗脫或再懸浮顆粒的核糖核酸酶是免費的。許多工具提供用水RNA工作DEPC治療或以其他方式淨化。更多背後的神話DEPC治療和rna可以在這裏閱讀。

此外,10種方法核糖核酸酶免費工作也可能是一個有用的文章。

3所示。問題:RNA的抑製劑
RNA異常低260/230閱讀(低於1.0)或260/280在逆轉錄閱讀或不工作。

原因:低260/230 RNA預科是指示性胍鹽攜帶到樣本或有機抑製劑(如胡敏酸或多糖如果樣品環境)。胍鹽是用於試劑盒和矽預備。這些鹽活性RNA,而且還會抑製蛋白質如RT酶如果出現在最後的RNA。低260/280測量表明蛋白質汙染。

解決方案:低260/230閱讀,最好的方法是嚐試洗的RNA樣品。如果這是一個試劑盒沉澱,試著用乙醇洗去淡化它。矽準備功課,多洗70 - 80%乙醇應明確列鹽。樣品已經純化不幹淨,乙醇沉澱RNA的淡化。

對於其他抑製化合物,胡敏酸和多糖等,你可能需要re-purify樣品另一列洗脫前洗好。這些化合物將不會從核糖核酸(DNA)與傳統的方法,因為他們太類似於核酸。在這種情況下,您可能需要考慮使用抑製劑除塵技術環境樣品。

低260/280閱讀從蛋白質攜帶最可能發生,因為使用過多的工具或方法的示例。樣品被化學和蛋白質並沒有完全刪除。試著清理另一輪的樣品你方法——要麼苯酚:氯仿和沉澱或添加綁定鹽和乙醇和綁定到另一個矽旋轉過濾器。蛋白質應該輕鬆刪除。下一次,試著用更少的樣本和確保同質化就完成了。

4所示。問題:低收益率的RNA
RNA的產量低於預期,要麼根據你以前的結果,或者,根據報道收益率為特定組織或細胞類型。RNA收益率不同的培養細胞類型之間有很大的差異,在不同的組織。為血RNA,它可以因人而異。

原因:如果RNA的收益率低於預期或知道它應該,RNA是完整的(閱讀:不是退化),均化可能沒有完成。孤立RNA,一個強大的溶菌作用是關鍵。組織存儲在RNALater會更難以同質化。低收益率可能造成的錯誤重的組織或細胞培養細胞。你可能比你想象的更少的細胞。血RNA,淡黃色的外套可以隨你的技能在收集白色細胞層和每個病人。

解決方案:的情況RNA收益率很低,但RNA是完好無損,專注於均勻化方法,確保你得到很好的剪切的基因組DNA和RNA從所有細胞的釋放。如果你看到任何的組織勻漿或碎片,那是失去了RNA。

很難衡量小塊組織所以確保你使用準確的重量需要規模或您可能會看到變化從預科到預備純潔和堵塞以及其他問題列太多時使用。對細胞來說,重要的是要有一個準確的數如果你想要有一致性。

如果RNA看起來退化,除了收益率低,同質化的問題可能是太難了,樣品加熱太久。試均質化的30 - 45秒30秒的休息。確保你的組織切片,把它切成冷胍裂解緩衝(或試劑盒)迅速建立期間防止核糖核酸酶的活動。

與矽自旋過濾器,確保列的洗脫體積足夠釋放膜的RNA。更多的水會洗提RNA所以使用允許的最大體積所需要的RNA一樣集中。不要嚐試使用更少的體積比推薦的製造商或你可能離開你的RNA在膜上。最好是洗提越來越集中在使用乙醇沉澱,如果最大複蘇是關鍵。

最後…

隔離的RNA類似協議無論樣本來源。所有樣品,均化是第一步,也是最重要的一步。良好的均化需要打破細胞迅速滅活核糖核酸酶裂解緩衝,並需要分解基因組DNA的大小使去除更有效。

2019年6月再版。