支原體汙染自製PCR檢測

支原體是對細胞培養的最大威脅之一——大多數做這類實驗的研究人員都害怕。

支原體汙染是相對常見的，可以持續很長時間而不被發現。通常，當使用不適當的工作技術時，一種受感染的文化可以傳播到其他文化。除了適當的安全措施(將新的細胞係置於隔離環境中，當使用不同的細胞係時對工作台進行消毒，使用相同的培養基…)使用PCR很容易檢測細胞培養物中支原體的存在。

雖然商業測試套件非常簡單和快速，但對於大多數實驗室的常規測試來說，它們通常太貴了。然而，商業試劑盒是不必要的，因為支原體檢測引物序列已經與常規方案一起發表。

下麵是我從Uphoff和Drexler那裏得到的自製支原體汙染PCR檢測方案^1、2．我建議每隔幾周例行做這個測試，並對每一個新的培養物進行汙染測試。如果有任何疑問，您也可以開始測試媒體、血清等。

訂購引物

您需要訂購多個正向和反向引物來檢測多種支原體。

正向引物

• Myco-5-1 CGCCTGAGTAGTACGTTCGC
• Myco-5-2 CGCCTGAGTAGTACGTACGC
• Myco-5-2 TGCCTGAGTAGTACATTCGC
• Myco-5-2 TGCCTGGGTAGTACATTCGC
• Myco-5-5 CGCCTGGGTAGTACATTCGC
• Myco-5-6 CGCCTGAGTAGTATGCTCGC

反向引物

• Myco-3-1 GCGGTGTGTACAAGACCCGA
• Myco-3-2 GCGGTGTGTACAAAACCCGA
• Myco-3-3 GCGGTGTGTACAAACCCCGA

準備引物組合

將每個引物溶解至最終濃度為100 μ M。將所有正向引物混合在一起，達到每個引物10µM的最終濃度。例如，如果你想準備100µl的引物混合物，每一種正向引物取10µl，加入40µl的水。以類似的方式混合所有反向引物。

準備樣品

從密集培養中取100 μ l細胞培養上清支流(80 - 100%)注入1.5ml試管(或培養基，血清，你想測試的任何東西)。在95°C加熱樣品5分鍾(使其變性)，並在台式離心機中以最大速度旋轉2分鍾。

建立聚合酶鏈反應

根據下表準備PCR反應混合物(可能需要根據製造商做一些調整)。記住，包括一個陰性對照樣品與水，以排除假陽性，如果你有一個陽性對照(如果你確定感染培養，你也可以使用這個上清作為陽性對照)。

試劑	卷(每毫升)
10 x PCR緩衝	2.5
25毫米MgCl2	2．0
10毫米核苷酸	1．0
正向引物	1．0
反向引物	1．0
細胞培養上清液	2．0
聚合酶	0.2
水	15.3
總計	25

進行PCR和運行凝膠

使用以下程序進行PCR:

一步	溫度(攝氏度)	時間
最初的變性	95	下午2分鍾
5個周期	94	破發秒
	50	破發秒
	72	0:35交會
30個周期	94	0:15交會
	56	0:15交會
	72	破發秒
商店	4	∞

• 最終的PCR應該是大約500個核苷酸，因此您可能需要根據聚合酶的建議調整擴展時間。對於Taq聚合酶，你需要大約35秒的擴增時間(已經包括一些安全餘量)。
• PCR經過5個特異性較低的循環，以確保擴增出多種支原體，然後再經過30個特異性較高的循環，以避免假陽性。
• 如果信號太弱，可以用35個周期而不是30個。

把樣本放在1.5%的瓊脂糖凝膠上。一個例子如下:

希望你的樣品不會被汙染，但如果被汙染了，安德魯·波特菲爾德的文章攻擊支原體感染我會告訴你如何應對。

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參考文獻

1. Uphoff CC, Drexler HG. (2002)連續細胞係支原體感染的比較PCR檢測．體外細胞發育生物動物。38(2): 79 - 85。
2. Uphoff CC, Drexler HG. (2004)用聚合酶鏈式反應檢測培養細胞中支原體汙染．摩爾醫療方法。88: 319 - 326。