前5個蛋白質定量測定法

當使用蛋白質時，準確的蛋白質定量是關鍵。但是那裏有很多方法，您怎麼知道哪種方法適合您？

在本文中，我們將討論五種主要的蛋白質量化技術 - 它們如何工作，工作時以及何時工作不工作。

為什麼準確的蛋白質定量很重要？

例如，如果您試圖確定結合常數，測量酶動力學或準備蛋白質印跡的樣品，則準確的蛋白質定量至關重要。即使您正在做一些更定性的事情，也可以很好地了解您擁有多少蛋白質可以使您可以將一個實驗的結果與下一種蛋白質進行比較。

有幾種測量蛋白質濃度的方法，並且每個方法都有其自身的優勢和缺點。可能很難為蛋白質做出最佳方法，尤其是考慮到即使是最謙虛的蛋白質定量測定法也使用了一些相當複雜的化學反應，可以使您興奮（尤其是如果您使用洗滌劑！）。

280 nm處的UV-VIS吸光度

簡單但通常不可靠，這種蛋白質定量方法通過在紫外線光譜儀上測量280 nm的芳香族殘基，酪氨酸和色氨酸的特征吸收來估計蛋白質的量。

一旦您知道280 nm的蛋白質吸收性（a）₂₈₀），以及其滅絕係數，您可以使用Beer -Lambert法來計算蛋白質濃度：

一個=εl c

在哪裏：

一個= 280 nm的吸光度。

ε=摩爾滅絕係數。

l=光譜儀的路徑長度。

C=蛋白質的摩爾濃度。

使用吸光度在280 nm處測量蛋白質濃度的優點

這是一種快速的方法，不需要任何特殊試劑，除了鳥可以的方法，無論如何您都可能擁有。

如果您使用純化的蛋白質樣品，並且您測量了蛋白質樣品的完整UV-VIS光譜，而不僅僅是A₂₈₀，您還可以通過尋找230 nm的吸光度來查看樣品中是否有可溶性聚集體。（1）

使用吸光度在280 nm處測量蛋白質濃度的缺點

每種蛋白質都有不同數量的酪氨酸和色氨酸殘基，而且您可能不知道蛋白質的實驗滅絕。僅這些因素就使該方法不可靠。

更糟糕的是，許多其他分子幹擾了這種蛋白質定量方法。醇，某些緩衝離子和核酸都在280 nm處吸收，因此，如果存在這些其他分子，則對蛋白質進行了非特異性測量。

如果您在蛋白質準備中使用DTT並使用₂₈₀測量蛋白質濃度 - 小心！隨著時間的推移，DTT會氧化，留下也以280 nm吸收的產品。這並不意味著UV-VIS與DTT不相容，而是意味著您應該使用一個精確的含DTT的緩衝液匹配以更準確​​地測量蛋白質濃度。

這可能很難做到，特別是如果您冷凍蛋白質並使用數周/幾個月，但是您不再具有確切的緩衝液可以空白的。在這種情況下，以下技術之一可能對您更有用。

布拉德福德分析

有充分的理由是，該論文首先描述了布拉德福德測定法案數千次！（2）布拉德福德分析是一種優雅的簡單比色測定法用於蛋白質定量。

它基於Coomassie Brilliar Blue之間的相互作用（您知道，您弄髒的東西SDS-PAGE凝膠帶有）和蛋白質中的精氨酸和芳族殘基。當染料與這些殘基結合時，其最大吸收從470 nm轉移到595 nm。

通常，您測量一係列已知濃度的標準蛋白[例如牛血清白蛋白（BSA）或牛γ-球蛋白（BGG）]的吸光度，以創建標準曲線。與Folin-Lowry方法不同，Bradford分析沒有設定的端點，因此您必須使用此標準曲線根據其吸光度來計算蛋白質濃度。

布拉德福德分析的優勢

Bradford蛋白質量化很快，易於穩定，最多一個小時，並且不會受到緩衝劑中的減少劑的影響，例如DTT或DTT或我最喜歡的Smelly Lab Chemical，β-羥基乙醇。

布拉德福德分析的缺點

但是，如果您的標準蛋白稀釋液不準確，那麼您計算出的蛋白質濃度將減少。重要的是，如果您的蛋白質對染料的反應與標準蛋白相似的化學反應，那麼您的濃度也可能不正確。

不幸的是，基本條件和洗滌劑（例如SDS）可以幹擾染料與蛋白質結合的能力。但是，有與洗滌劑兼容的布拉德福德試劑。

此外，像紫外線一樣₂₈₀技術，布拉德福德測定法取決於蛋白質的順序。如果您的蛋白質不含數量不錯的精氨酸和/或芳香族殘基，則該染料不會有效地與蛋白質結合，從而低估了蛋白質濃度。

二甲酸（BCA）測定法

BCA分析最初於1985年開發，是另一種比色測定法。（3）此兩步測定首先利用雙尿素反應，其中蛋白質骨架螯合物Cu²⁺離子並將它們降低到銅⁺離子。在第二步中，Cu⁺離子與BCA反應形成在562 nm處吸收的紫色產品。

方便地，顏色強度與蛋白質的量成正比，並且像布拉德福德測定法一樣，也必須將每個樣品的強度與基於一係列已知蛋白質標準的標準曲線進行比較。

BCA分析的優勢

由於肽主鏈參與反應，因此BCA分析受氨基酸組成差異的影響較小。然而，該反應受半胱氨酸，酪氨酸和色氨酸殘基的影響。此外，BCA試劑對洗滌劑和變性劑不敏感，因此可以將其放在緩衝液中是可以的。

該測定可以輕鬆在96孔板中進行，以提高便利性並允許高通量蛋白質定量。

BCA分析的缺點

緩衝液中還原劑的存在可能會幹擾測定，但可提供降低的代理兼容套件。

反應需要一些時間才能進行。通常，將樣品在37°C下孵育15–30分鍾。隻有足夠的時間喝咖啡。另外，如布拉德福德測定法中，您可以通過從已知的標準蛋白質中創建標準曲線來確定蛋白質濃度。因此，同樣的陷阱也適用。

雖然比布拉德福德測定法慢，但如果您的蛋白質樣品含有> 5％的洗滌劑，則BCA分析是一個不錯的選擇。與布拉德福德測定法相比，它對不同的蛋白質的反應更均勻，盡管它仍然受到酪氨酸，色氨酸和半胱氨酸氨基酸的存在的強烈影響。

但是，由於它依賴於銅的第一反應，因此與銅相互作用（例如氨）的化學物質也會幹擾BCA分析。

葉 - 低脂測定法

與BCA分析類似比色測定法還涉及兩個步驟，其中之一還包括Biuret反應。首先，它將銅與蛋白質中的氮配合在一起。其次，複合的酪氨酸和色氨酸與葉藻酚酚試劑（“磷酸苯二酚”對其朋友）反應，以賦予強烈的藍綠色顏色，可在650-750 nm處吸收。在室溫下30分鍾的孵育期間，這種藍色會增強。（4）

Folin -Lowry分析的優勢

Folin -Lowry測定法的一個優點在於靈活性在650 nm至750 nm之間測量，顏色強度幾乎沒有損失。盡管如此，最好以750 nm的速度測量，因為在此波長下很少有其他物質吸收。但是，重要的是要記住，與BCA測定法不同，葉 - 低標準曲線是非線性的。

另一個優點是，這是一個端點測定，其結果穩定，這意味著您可以通過將其與先前的標準曲線進行比較來估算一個測定中的蛋白質量！

Folin -Lowry分析的缺點

不幸的是，該測定法與許多常見的化學物質不兼容：EDTA，TRIS，碳水化合物，還原劑（例如DTT，β-羥基乙醇），以及鉀離子和鎂離子都是不可能的。

令人討厭的是，必須在10分鍾孵育期結束時精確地將葉酚試劑添加到每個樣品中。如果您有很多樣本來測量此方法，則可以限製可以在運行中測定的樣本數量，並且您可能需要練習以獲得一致的結果。對於那些喜歡大個子或回家的人來說，這並不是很好！

Kjeldahl方法

這Kjeldahl方法是132年曆史的方法這可以通過一係列涉及加熱硫酸，蒸汽蒸餾和用氫氧化鈉進行後遞增的可怕步驟轉化為氨後，測量蛋白質樣品中的氮。（4，5）在所有工作之後，您權衡了純化的氮，並且假設您的原始蛋白質樣品為16％的氮，則可以將蛋白質的總量降低。哎呀！

Kjeldahl方法的優點

該方法的強度在於其精確性和可重複性。它用於測定食物，土壤，廢水和肥料中的蛋白質含量。

Kjeldahl方法的缺點

Kjeldahl方法乏味且耗時，至少需要1個公克樣本，使其對於大多數分子生物學家而言，尤其是像我一樣，您很難生產出您感興趣的蛋白質！

另外，該方法測量了蛋白質中非蛋白質氮和氮，並且不能準確地衡量真正的蛋白質含量。

蛋白質定量測定總結

表1總結了每種蛋白質定量方法的關鍵優勢和缺點。

表格1。前5個蛋白質定量測定法

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最初出版於2015年5月27日。更新並重新發布了2022年6月。

參考

1. 劉pf，等。（2009）作為蛋白質展開探針，在230nm時重新訪問吸光度。肛門生物化學。389（2）：165-70。
2. 布拉德福德MM。（1976）一種快速而敏感的方法，用於定量利用蛋白質結合原理的蛋白質微克量。肛門生物化學。72：248-54。
3. 史密斯PK，等。（1985）使用二金雞寧酸測量蛋白質。肛門生物化學。150（1）：76-85。
4. “蛋白質測定的化學。”生活技術2015。
5. Robyt JF和White BJ。生化技術：理論和實踐。第7章：確定生物分子的方法。1987年。Waveland Press，Inc。