了解你的DNA聚合酶
雖然大多數可能認為標準TaqPCR的支柱,還有許多其他的DNA聚合酶的選擇。你使用的聚合酶有顯著影響PCR的功效,特別在產品產量、產品的純度和產品被轉錄起始的忠誠。有時候,這些物質少,快速和肮髒的PCR是你所需要的,但如果他們這樣做了,你有其他選擇!
我們走在不同類型但首先,購買聚合酶時,你尋找什麼?
聚合酶需要什麼有用嗎?
首先,它需要最佳活躍在溫度超過75°C。接下來,它不能中途失去勢頭PCR運行,它應該保持其活動經過長時間的培養。還應該在95°C左右的高溫耐熱性的,否則當你變性DNA酶將成為無用的!最後,看它的校對和檢查你的錢,這是最好的選擇對PCR你做的類型和您所需要的產品的質量。
一旦你走了Taq你永遠不回來
為什麼Taq你可能會問這麼受歡迎?首先它先到達那裏!它還適用於簡單,常規PCR。
Taq聚合酶的命名嗜熱細菌水生棲熱菌它是孤立的1965年,托馬斯·d·布魯克。它能夠承受高達97.5°C的最佳活動範圍75 - 80°C是一種理想的PCR,因此已經成為標準的聚合酶用於PCR反應。
的缺點Taq聚合酶
不幸的是,的活動Taq高峰在72°C,但活躍在較低的溫度下,可鼓勵引物二聚體的形成。引物也傾向於把流感在低溫下,這會導致非特異性PCR反應產品,和標準Taq隻會鼓勵這種行為!出於這個原因,標準Taq最好使用受信任的PCR協議不要求大量的優化。
標準Taq也不是特別準確,與報道的錯誤率在1.1 x 104錯誤每個堿基對重複和8.9 x 105每個堿基對重複錯誤,所以如果你正在尋找一個高保真的產品,看其他地方。
如果你不能讓你的臉Taq去
Taq主張(Taq靜靜? !)將很高興知道over-eagerness的解決方案是可用的Taq:HotStartTaq又由於“快速上手”項目Taq。熱態啟動TaqDNA聚合酶的混合物TaqDNA聚合酶和aptamer-based抑製劑。這勢必可逆抑製劑酶,抑製其酶活性在溫度低於45°C。一旦達到這個溫度,酶的抑製劑釋放。這意味著HotStartTaq沒有活動在較低的溫度。一個單獨的釋放酶活化一步不是必需的,因為這反應是納入的30 - 40周期開始的PCR (95°C, 2 - 4分鍾)。有許多公司提供熱起動Taq包括新英格蘭生物學實驗室,試劑盒,生活的技術和Promega。HotStartTaq選擇是非常受歡迎的,可以用於大多數類型的PCR,但是如果你有時間序列,GC-rich序列或者要求極高的忠誠度,繼續讀下去。
出於完整性的考慮,我還提到另一個選擇:熱啟動PCR。
酶的組合
雖然標準Taq不是一個好的校對,並將離開拚寫錯誤在你的產品,許多公司正在出售Taq與耐熱性的混合,校對聚合酶,如Toyobo和生命科學的。這些混合物是一個偉大的選擇,目標上的長邊(5 kb)。
如果你有一個GC-rich目標序列或一個目標高度重複序列,酶組合也可能適合你,等這一個羅氏。這個係統還使用一種特殊解決方案優化放大的GC富裕地區,又依賴於一個額外的校對聚合酶。
GC-rich序列和克隆的另一個選擇多個目標在一個反應(多重PCR)或如果你需要最忠實的轉錄,高保真熱態啟動聚合酶等這個由新英格蘭生物學實驗室。他們可以更昂貴所以一定前你需要投資!
空斑形成單位聚合酶
的一個主要聚合酶的人當他們需要高保真空斑形成單位(海床furiosus)DNA聚合酶。這些聚合酶是隔絕海床furiosus古生菌的extremophilic物種,在極高的溫度下茁壯成長。這個聚合酶分別是理想的克隆產品排序,突變或表達實驗。不像TaqDNA聚合酶,空斑形成單位DNA聚合酶具有3′,5′核酸外切酶校對活動,這意味著它的DNA從5′末端3′末端和糾正nucleotide-misincorporation錯誤。這意味著空斑形成單位DNA polymerase-generated PCR碎片將會有更少的錯誤Taq生成的PCR插入,錯誤率約1.3×10出版6嗎?每個堿基對重複錯誤。空斑形成單位的缺點是它的速度是慢的Taq。結合空斑形成單位和Taq給你最好的選擇,因為你得到的速度Taq的忠誠空斑形成單位。
克服dUTP中毒空斑形成單位
空斑形成單位還患上dUTP中毒和與變體叫做補救空斑形成單位渦輪(空斑形成單位和ArchaeMaxx因子組合)。dUTP中毒是由於積累的dUTP dCTP脫氨基作用和結果在減少校對你的酶。ArchaeMaxx dUTPase,將有毒的dUTP轉化為無害的轉儲(一個相當美妙的名字!)+ iPP
工程酶
為了進一步提高保真度也在伸長的速度提高,創建了新形式的聚合酶。很多設計師酶是基於或修改形式的空斑形成單位DNA聚合酶。修改允許酶的速度增加以及校對工作能力,所以如果你需要快,非常高保真酶的這些都是你,一直都在尋找。這些例子包括內的Phusion聚合酶基因,有一種聚變的DNA聚合酶和安捷倫科技公司的空斑形成單位超二融合HS DNA聚合酶。
處理長PCR產品
如果你有一個長得出奇的序列多達25 kb的別擔心,有遠程混合物可用,如這一個羅氏公司,再使用一個校對酶還特別緩衝區或者你可以試著用Stoffel片段,由一個截斷Taq基因編碼的一種蛋白質缺乏5′3′核酸外切酶活動允許它放大目標超過本機酶。
RNA擴增聚合酶鏈反應
t聚合酶(棲熱菌屬酸奶HB-8)逆轉錄酶活性混合後與錳離子,因此可以用於放大的互補的RNA。這種聚合酶耐熱性的高溫(95°C長達20分鍾),使得它非常有用的RT RNA二級結構可以是一個問題。然而,它還缺少3′?5′核酸外切酶活動的意義沒有校對的能力在這個方向,所以最好是結合校對酶。有很多公司提供包括Promega,羅氏公司和affymetrix。
創建鈍結束
發泄®(Thermococcus litoralis)是另一個非常的聚合酶耐熱性的高保真選項,可用於創建一個產品由約95%的生硬的結束。DeepVent™可以使用如果你需要熱穩定性的溫度超過95°C或如果需要酶耐熱性的長時間的煮,也可以使用創建鈍結束。DeepVent結合使用Taq創建選項和是由長序列新英格蘭生物學實驗室這僅僅提供一種改進的忠誠率Taq(兩個),它有校對3 ' 5 '核酸外切酶的能力Taq缺乏。生命科學有類似的發泄。
短期目標序列
Pwo(海床woesei)是一個不太知名的選擇和適用於序列下3 kb。Pwo休息的時候到達錯誤的尿嘧啶(U)的DNA鏈延伸,通過這個閱讀功能,合成的DNA克隆缺陷更少。Pwo可以從羅氏公司和Genaxis。
你知道任何你想使用嗎?在下麵的評論中告訴我們。