嬰兒有BAC -使用細菌人工染色體

雖然他們可能不是一樣的需求時,測序項目的基礎上,細菌人工染色體()還用於各種各樣的項目。基於F起源的複製,BAC載體可以穩定維持到300 kb的序列在一個質粒,貸款本身有用的各種研究。

然而,盡管他們可能看起來像任何其他質粒,與BACs不是一個簡單的任務。•巴維護作為一個單獨的副本在每一個細菌細胞,大大減少產量,和大型的DNA序列是極其脆弱的。

以下是幾個最好的技巧,我學會了在我的時間處理這些質粒。

擴大

與標準質粒可以複製到數以百計的副本每個細胞,BACs維護作為一個單獨的副本在每一個細菌細胞。因此,5毫升文化一般不會產生可用於微克的DNA。你需要擴大到50毫升,100毫升,甚至1 L文化和質粒穩定性取決於您的應用程序。

此外,您可能需要調整DNA的數量添加到反應。例如,如果您正試圖切除5 kb片段從10 kb質粒,1µg消化會產生500 ng DNA,以供將來使用。然而,如果你正試圖切除5 kb片段從250 kb BAC, 1µg消化隻會生產20 ng的DNA,以供將來使用。作為一個結果,你需要消化25µg 250 kb的BAC得到相同的收益!

忘記自旋列

自旋列在許多實驗室已經成為標準的淨化的DNA,但大多數列隻能夠處理DNA片段15 kb。由於BACs遠高於限製,您需要嚐試乙醇沉澱等方法淨化。除了DNA純化,許多質粒和凝膠提取工具基於自旋列,所以一定要事先研究大小限製任何包。

小心輕放

遠離那漩渦!大的DNA片段是脆弱的,除非在超螺旋形式,必須認真處理。作為10秒漩渦一樣簡單的事情就能片段的DNA,你花了這麼多時間淨化。因此,除非你確信超螺旋的DNA完全形式,避免渦流和反複凍融循環。事實上,除非我不使用BAC在較長一段時間,我商店樣品在4°C,防止退化。

考慮提取工具

如果你通常執行一個alkaline-lysis質粒提取的基礎上,有選擇巴然而有風險增加導致DNA剪切。此外,至少以我的經驗,通常有一個更高的基因背景汙染。因此,淨化的選項通常建議•巴沒有裝備是通過氯化銫梯度,但誰想混亂嗎?

越容易的選擇,在我看來,是咬緊牙關,使用BAC-specific淨化設備。有多家公司提供這些工具,在大多數情況下他們依靠大型解列。雖然這些工具很貴,他們的速度比大多數手工方法,結果通常是非常純,完整的DNA。

使用BACs可以是一個艱巨的任務,但不是不可能的。隻要你記得關注你的質粒的規模,和你使用任何工具的大小限製,你很快就會掌握處理這些令人印象深刻的大