使用TRIZOL®方法提取和增溶蛋白質gydF4y2Ba

從組織樣本和培養細胞中提取蛋白質是許多生化和分析技術的第一步。在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、Western blot或質譜分析之前，您需要提取蛋白質。如今，許多實驗室已經改用試劑盒進行蛋白質提取，但這些試劑盒可能更昂貴，而且蛋白質產量可能比我今天要談論的經過試驗和測試的方法——TRIZOL®方法更低!gydF4y2Ba

現在，您可能聽說過TRIZOL®提取可能有點麻煩，特別是對於初學者。但別擔心，這真的沒那麼糟。為了從細胞和組織中獲得驚人的結果，新鮮和冷凍的樣本都值得仔細地移液。此外，這項技術也可以用來提取DNA和RNA!gydF4y2Ba

簡介gydF4y2Ba

在我們進入正題之前，讓我告訴你這個方法中的重要角色:gydF4y2Ba

• 試劑盒®gydF4y2Ba也就是TRI試劑，因為它被稱為gydF4y2Ba創造者gydF4y2Ba，溶解生物材料，變性蛋白質。它被用來破壞你的細胞並溶解它們的細胞成分。gydF4y2Ba

• 氯仿gydF4y2Ba．離心後，氯仿將TRIZOL®溶液分離為兩個相:水相和有機相。水相將包含RNA，稍後可以用異丙醇沉澱。有機階段將包含你的DNA和蛋白質。gydF4y2Ba

• 乙醇gydF4y2Ba．一旦你吸掉了水相，你就可以用乙醇從有機相中恢複DNA。gydF4y2Ba

• 異丙醇gydF4y2Ba．一旦你除去了DNA，你可以執行一個額外的沉澱步驟，使用異丙醇來分離你的gydF4y2Ba蛋白質gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

談正事gydF4y2Ba

如果你正在使用細胞，並希望量化蛋白質的數量，你需要從已知數量的細胞開始。如果你使用的是組織，無論是新鮮樣本還是冷凍在液氮中的樣本，其過程與培養細胞相同。唯一不同的是，培養的細胞顆粒隻是簡單地重懸在TRIZOL®中，而組織樣品需要積極均質。記住，如果冷凍，在均質化之前，讓你的組織有時間融化。gydF4y2Ba

步驟1。gydF4y2Ba

用70%乙醇清潔通風櫃。gydF4y2Ba

步驟2。gydF4y2Ba

如果你正在處理一個組織樣本，使用鑷子增加大約1毫米gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba將您的組織樣本放入1毫升冰水TRIZOL®中，並確定樣品的重量。如果你的樣品是新鮮的，把它放在冰裏。如果你的樣品是冷凍的，在室溫下解凍5分鍾後再放在冰上。把你的樣品放在冰上5分鍾。gydF4y2Ba

如果您正在處理培養細胞樣本，將所需數量的細胞加入1.5 ml eppendorf管中，離心至300gydF4y2BaggydF4y2Ba5分鍾。這將使你的細胞形成顆粒。接下來抽吸培養基，將細胞重懸於1毫升冰水TRIZOL®(5-10 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba細胞/1毫升)，放置在冰上5分鍾。gydF4y2Ba

步驟3。gydF4y2Ba

每1毫升TRIZOL®加入200 μ l氯仿，大力搖晃樣品15秒，並在RT下停留3分鍾。12000度旋轉gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置15分鍾。這將分離水層和有機層。gydF4y2Ba

步驟4。gydF4y2Ba

抽吸透明的上層水層(組織約700 μ l，細胞約400 μ l)。這一層包含你的RNA。一旦完成，每1毫升TRIZOL®添加0.3毫升100%乙醇到剩餘的有機層。反複反轉混合樣品，室溫靜置2-3分鍾。gydF4y2Ba

第5步。gydF4y2Ba

然後用2000度離心沉澱你的DNAgydF4y2BaggydF4y2Ba在大約4°C下加熱5分鍾。然後沉澱你的蛋白質(大約0.8毫升每1毫升TRIZOL®)與1.5毫升異丙醇每1毫升TRIZOL®。在室溫下放置樣品10分鍾。gydF4y2Ba

步驟6。gydF4y2Ba

用12000度離心樣品gydF4y2BaggydF4y2Ba在大約4°C下加熱10分鍾。去除上清液，在0.3 M鹽酸胍95%乙醇溶液中洗滌蛋白顆粒三次。gydF4y2Ba

步驟7。gydF4y2Ba

每1ml TRIZOL®試劑加入2ml鹽酸胍洗滌液用於初始均質。在每個洗滌周期中，在室溫下將蛋白質顆粒存儲在洗滌液中20分鍾，然後以7500離心gydF4y2BaggydF4y2Ba在大約4°C下加熱5分鍾。將蛋白顆粒放入2毫升乙醇中，在室溫下靜置20分鍾。gydF4y2Ba

步驟8。gydF4y2Ba

7500離心gydF4y2BaggydF4y2Ba在大約4°C下加熱5分鍾。去除上清液，留下顆粒。讓顆粒風幹不超過10分鍾。通過移液將其溶解在1% SDS中。蛋白質顆粒的完全溶解可能需要在50°C下孵育樣品。gydF4y2Ba

第9步。gydF4y2Ba

10000離心gydF4y2BaggydF4y2Ba在大約4°C下浸泡10分鍾，並將上清液轉移到新鮮試管中。樣品可以隨時使用，也可以在-20°C保存。gydF4y2Ba

有關不同樣品量的蛋白質含量以及DNA和RNA分離和溶解的詳細信息，請參見gydF4y2Ba在這裏gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

提示，故障排除和技巧gydF4y2Ba

• 如果你想保持你的RNA完整，在開始之前用RNase ZAP和乙醇清潔你的引擎蓋。就這一點而言，你也應該這樣做gydF4y2Ba清洗你所有的吸管gydF4y2Ba以及任何裝有乙醇和RNaseZAP的支架、尖盒等。gydF4y2Ba

• 如果你使用1.5 ml的eppendorf管，它可以是非常困難的充分均質組織和在一個良好的時間。你可能想在一個更大的錐形管中進行均質步驟。gydF4y2Ba

• 為了確定組織樣本的重量，預稱含有TRIZOL®的2 ml eppendorf。加入樣品後再稱重。從試管的無蛋白重量中減去你的答案。gydF4y2Ba

• 將TRIZOL®添加到細胞或組織樣本後，它們可以在-80°C保存。然後您可以稍後處理您的樣本。gydF4y2Ba

• 隻要有可能，就把你的樣品冷藏起來。gydF4y2Ba

• 過度幹燥你的蛋白質顆粒是災難性的!如果你的樣品在10分鍾後還沒有幹，那就繼續。為了幫助它幹燥，我喜歡把管子倒在廚房紙上，但要有一個角度，這樣液體就會形成一個液滴，順著一邊流下來。你也可以拿一小片紙輕拍邊緣，幫助它移動。不要用力敲擊管子，你的小球可能會脫落!這樣做的目的是去除多餘的水分，但不要讓顆粒變幹。gydF4y2Ba

隔離快樂!gydF4y2Ba