當PCR得到RACE-y:從未知的mRNA片段到測序的cDNA

通常你需要兩個引物來放大你感興趣的片段-一個用於3 '端，一個用於5 '端。但如果你不知道你希望放大的區域的序列，這可能是一個問題!cDNA末端快速擴增(RACE)是一種PCR協議，允許您從僅部分測序的mRNA中測序全長cDNA。

那麼RACE PCR是如何解決這個問題的呢?

有兩種形式的RACE PCR可供您使用:3 ' RACE和5 ' RACE。這兩種方法都是從逆轉錄的步驟開始，得到cDNA，然後用它來工作。接下來發生的事情對每個人來說都有點不同，這一切都取決於你知道整個序列的哪些部分，哪些部分你不知道。

讓我們看看這是如何完成的。別擔心，我會慢慢來，因為這可能會有點複雜，而且這不是一場比賽(tee hee)。

5英尺賽跑:基礎

如果你知道mRNA的3 '端，但不知道5 '端，這個方法就是解決方法。要進行5 ' RACE(圖1)，也稱為“錨定”PCR，需要在mRNA上添加一個5 '帽。這是用添加A-和t -堿基的酶添加的。在那之後，你可以用一個5 '帽引物和一個已知3 '序列的引物來放大你的序列——很簡單，對吧?!

圖1

3英尺賽跑:基礎

如果你知道mRNA的5 '端，但不知道3 '端，這個方法就是解決方法。3’RACE(圖2)通過巧妙地利用mRNA中天然的poly(A)尾巴發揮作用。利用聚(A)尾作為引物位點進行PCR擴增。為了使3 ' RACE起作用，你需要在mRNA的5 '端設計一個引物，並設計一個poly(a) tail(適配器)引物，以大量生產未知序列的副本。

圖2

好吧，是的，當你把它簡化到這麼多的時候，它就超級簡單了。是的，在現實中情況要複雜一些。從好的方麵來看，這兩種方法通常都很有效。現在讓我們更深入地了解一下。請注意，這種技術有許多不同的變化，它們有自己的細微差別。

去參加比賽

第一步是逆轉錄，正如你可能已經猜到的那樣:RT-PCR中的逆轉錄酶。沒有什麼出乎意料的，但還不止於此。雖然有很多方法可以實現這種技術，但我們將使用本指南作為參考，因為這兩種方法都很容易理解，而且寫得很周到。現在讓我們來看看:

5 '比賽

步驟1。cDNA合成步驟。

任何RACE實驗的第一步都是逆轉錄以生成你的cDNA。包含已知和未知序列的mRNA被用作逆轉錄合成cDNA的模板。首先，一個與已知序列反義的基因特異性引物(GSP)和一種逆轉錄酶被用來通過逆轉錄生成cDNA。下一個末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)被用於將胸腺嘧啶序列或均聚尾添加到cDNA的5 '端，以創建一個5 '帽。

步驟2。5 '競速步。

在5 ' RACE中，您現在將使用基因特異性反向引物(GSRP)對抗已知序列，並使用5 '通用引物對抗t -堿基帽來生成PCR產物。這將產生一個由你感興趣基因的5 ' -區域組成的產品，嵌套在5?-Primer和GSRP。

3 '比賽

步驟1。cDNA合成步驟。

在3 ' RACE中，您將利用mRNA中的天然聚(A)尾作為PCR擴增的通用引物位點。雖然不隻是使用寡核苷酸(dT)引物，但使用了聚(a)尾適配器。該適配器是結合互補聚(a)尾的T堿基鏈，但在其前麵有一個適配器序列。

步驟2。3英尺競速步。

然後使用基因特異性引物(GSP)和反義引物從已知區域擴增3 ' cDNA。這個反義引物是你在步驟1中添加在尾部的適配器序列的補充。

簡而言之

3 '和5 ' RACE都允許你通過基因特異性引物和某種通用適配器引物對未知序列進行測序。如果你試圖放大未知序列的mRNA, RACE是一個聰明的方法——如果你研究不尋常的生物體，這是一個常見的問題。我鼓勵你們嚐試一下。

希望我幫助“e-RACE”任何困惑你有關於種族!