如何最好地提高你的慢病毒效價嗎

如果你計劃使用慢病毒為您的下一個實驗中,很有可能你想多少病毒使用。為在體外工作,感染複數(MOI)是理論每個靶細胞的病毒粒子應用數量。也就是說,如果你有100萬個細胞,你想要一個我5,你需要有500萬個慢病毒顆粒的轉導。

一旦你有了一個粗略的病毒粒子的數量,你可以計算體積和所需的病毒效價達到你的目標莫伊。然而,在這個階段研究新基因治療工作經常遇到的問題。有理想的慢病毒量計算的實驗中,他們發現收益率從他們的慢病毒產量太低了。這通常會導致重複嚐試產生更多的病毒,導致進一步的沮喪——同事和商業提供者通常實現高滴度!為什麼我不能呢?

不要恐慌時出錯!

在你開始沒完沒了的優化(不同的轉染試劑,新細胞,等等),放下你的吸管,聽好了!很可能慢病毒效價低不了你是一個不稱職的實驗室黑猩猩。有幾個因素不同程度的控製慢病毒效價。

什麼因素控製慢病毒效價?

1. 293年生產的細胞

首先,很高興你293生產者細胞:

• 沒有具體的限製的次數可以通行你的細胞之前你看到病毒效價下降,但細胞分裂必須健康積極。
• 樹木叢生的文化有很多衰老細胞不會產生良好的濃度。
• 之前一直做一個測試你的細胞轉染病毒生產。如果你的轉染效率是可憐的病毒是沒有意義繼續生產。新細胞需要股票!

2. 培養條件

最好把你的細胞轉染的前一天,以確保他們是快樂和健康。最佳的細胞confluency轉染時取決於你選擇的轉染劑。慢病毒顆粒對pH值的變化很敏感,所以消息靈通的緩衝區添加到培養基pH值可以防止病毒的極端。

3. 轉染

有效的病毒生產,你需要得到你所有的質粒在細胞的最大數量,所以不用說,你需要最好的轉染效率。有許多不同的商業和非商業轉染試劑可用。

記住,如果你需要準備定期慢病毒,商業轉染工具可以是一個昂貴的選擇。廉價的化學試劑如磷酸鈣和表麵(PEI)很好地工作,具有成本效益的。有一些證據(主要是坊間)一定的轉染試劑導致更高的病毒滴度。小心解釋這些結果,因為沒有真正的共識的最佳試劑使用。如果你是,你當然可以比較轉染試劑,但不要花幾個月在這一步。如果你得到好的細胞轉染的最好堅持你所使用。

4. 質粒

你的慢病毒質粒不需要使用特定的方法純化。無論如何你的教授聲稱是在1998年做的事情,你不需要使用超級純endotoxin-free包或氯化銫!隻是確保你的質粒是良好的質量和合理的濃度(超過100 ng /µl)。再一次,不值得沉迷於這一步。它實際上可能使病毒從普通miniprep DNA,盡管您可能會看到效價下降。

至於包裝質粒去,主要規則是不使用3^{理查德·道金斯}一代質粒2^nd代慢病毒。第二代轉移質粒需要hiv - 1蛋白質的存在,已從3^{理查德·道金斯}一代係統。有一些證據表明,2^nd代質粒時可能會產生高滴度用來包3^{理查德·道金斯}一代轉移質粒,但是差異(如果有的話)可能是微不足道的(1)。

5. 慢病毒質粒轉移

的轉移質粒包含轉基因(成分、gRNA非編碼序列等)的興趣。這個質粒還包含了hiv - 1長末端重複序列(LTR),病毒生產的必要條件。

質粒設計和施工

• 病毒生產開始之前,檢查你的質粒通過測序和/或限製消化,確保不發生重組或刪除。慢病毒質粒容易突變在某些菌株——使用recA應變(例如Stbl3, SURE2)如果可能的話。試圖讓病毒使用損壞的質粒轉移幾乎注定要失敗。看看這個文章建議選擇合適的菌株。
• 在設計你的質粒轉移,不包括你的轉基因後直接聚序列。3′hiv - 1 LTR已經包含聚(序列;所以插入另一個將減少質粒的穩定性和病毒效價。
• 也有證據表明,使用多個啟動子發表在慢病毒質粒的結果(2)啟動子幹擾。這意味著一個或兩個啟動子影響表達。這種現象可以減少轉基因表達和潛在的病毒效價。

轉移質粒對病毒效價的影響

既然你已經健康細胞,轉染試劑和正確的包裝質粒,你準備讓病毒!但是現在我們在病毒產量最重要的因素:轉移質粒本身。

所有的慢病毒質粒轉移並不是平等的。影響病毒效價的主要因素之間的序列的長度是兩個hiv - 1公升。收益率穩步減少,可以預見的是包裝變長序列。例如,如果您的質粒轉移包含一個簡短的啟動子驅動一個小轉基因如熒光蛋白,你很可能會看到好滴度。相反,如果你們使用轉移質粒與幾個轉基因病毒,多個啟動子和元素如忿怒和WPRE序列,你的病毒效價會低得多。

不同的轉基因產品也會影響效價。細菌蛋白質如Cas9和腦細胞似乎缺乏容忍到293年生產細胞,病毒生產產生不利影響。

很難誇大的成功是多麼重要的質粒轉移你的慢病毒生產。大於50倍並不少見病毒效價不同批次生產的差異同時使用相同的試劑,但不同的質粒轉移。下麵的圖1說明了慢病毒效價的變化可能發生根據質粒轉移。

圖1:慢病毒用於感染293 t細胞表達綠色熒光蛋白。熒光顯微鏡用於說明各種因素如何影響慢病毒效價和轉基因表達

因此,啟動子的選擇也會導致效價的變化取決於你如何評估轉導。Fluorescence-independent藥物選擇等方法qPCR和RT-qPCR可以使用相反,但他們通常更昂貴,勞動密集型的。圖1 b說明了一個問題,可以讓你的病毒效價計算。熒光顯微鏡是一個快速、簡單和廉價的方法來測量傳導,但蛋白質表達水平將影響你的計算。例如,熒光蛋白表達可能會減少高達80%,如果編碼基因的下遊IRES序列。在這種情況下,你可能有很多病毒轉導但如果熒光信號弱,你低估了風險病毒效價。流式細胞儀通常比顯微鏡更敏感,但弱熒光仍然可以導致低估的效價。

展望未來

帶回家的消息是避免關注小的調整,導致你花多餘的不必要的時間和金錢。質粒轉移通常是最大因素控製效價所以沒有多大意義的糾纏於優化步驟導致效價提高10%如果你轉移質粒產量減少50%。

病毒開始生產之前,計劃你的實驗和計算你需要多少病毒。在體外實驗通常不需要非常集中的病毒,所以沒有點的目標實際上非常高的濃度,如果你不需要它們。更大並不總是更好!顯然最好有良好的細胞轉染水平但你可能不會茁壯成長莫伊1000如果你轟炸他們。是現實的。

如果你的病毒預備不產生足夠的實驗計劃,考慮re-cloning或重新設計你的質粒轉移。看起來像一個不必要的彎路,但它可以節省你的時間,金錢和理智最後!

引用

1. 無聊的T, Zufferey R,凱利M,曼德爾RJ,阮M, Trono D, Naldini l . (1998)。第三代慢病毒載體條件包裝係統。微生物學報,72 (11):8463 - 71。
2. 田N, Hanawa H,山本M,島田(2013)。雞敏感網站4核心絕緣子塊子幹涉慢病毒載體。哼基因方法。2013年4月;24 (2):117 - 124。