對湯至關重要，對實驗室至關重要:基因表達序列分析(SAGE)，第1部分

有些技巧可能聽起來很枯燥，但這不是其中之一!

SAGE是由Velculescuet al。1995年．當時，RNA印跡和表達序列標記等技術被用於研究基因表達。然而，像這樣的技術是緩慢和非常有限的。SAGE的速度和研究許多基因的能力，小到10-14bp，是遺傳學的一個巨大進步。

SAGE允許你數字分析基因表達模式。不僅僅是幾個基因，而是整個細胞的基因表達譜。SAGE從mRNA開始，以整齊的圖表結束，讓你可以比較正常、發育和病變細胞的基因表達。我打賭你可以想象很多時候這將是有用的。讓我們來看看這項技術是如何工作的。

SAGE是如何工作的?

讓我們來看看這些步驟:

首先，你需要準備你的cDNA並純化你的cDNA:

步驟1:分離你的mRNA，使用逆轉錄酶和生物素化引物進行逆轉錄，生成相應的cDNA。使用生物素化可以讓你分離你的cDNA在之後的過程中。

步驟2:將你的cDNA與鏈黴親和素珠混合。這些小珠會與生物素- cdna複合物結合。(你可能從western blotting和免疫組織染色技術中認識到鏈親和素-生物素的相互作用——鏈親和素-生物素是一種非常強的結合，在許多技術中都很有用。)

步驟3:接下來用一種叫做錨定酶的限製性內切酶對cDNA進行裂解。如果你還記得生物化學101:限製性內切酶在特定的點切割，稱為限製性內切位點。所以你選擇的酶取決於你想讓它切到哪裏。廚師的選擇。由於每個cDNA片段都是不同的，每一個都將在不同的地方被切割。位置取決於限製性內切酶對應位點在單個片段上的位置。這種裂解的結果是，珠子與不同長度的cDNA片段結合，在其暴露的末端具有相同的序列。

步驟4:現在通過漂洗去除不再與珠子結合的cDNA。剩下的結合cDNA被分成兩個溶液。

圖1:SAGE工作流程。

其次，你需要將你的cDNA連接到標簽上:

步驟5:然後將寡核苷酸(A或B)添加到每個溶液中。你可以看到oligo A和B被加入圖1在你的樣本被分成兩個樣本之後。這些A和B寡核苷酸有幾個顯著的特征:1)含有錨定酶切割位點的附著位點或“粘端”。這些吸附位點在被消化時會與裂解的cDNA結合。2)另一種限製性內切酶的識別位點，稱為標記酶。3)和一個短引物序列，可以結合適配器a或B(這將在後續PCR步驟中使用)。適配器A和B連接到cDNA上。

步驟6:現在一種標記酶被用來切割cDNA。這將從珠子中移除cDNA，創建一個大約11個核苷酸(+4個核苷酸對應於錨定酶識別位點)的短“標簽”。

第七步:這些標簽末端有粘性，但可以用DNA聚合酶(DNA)修複。這就得到了鈍端片段仍然與適配器結合引物-錨定酶位點-標記酶位點寡核苷酸。

第三，將標記的cdna連接在一起:

第八步:現在是時候將鈍端標記連接在一起，以生成帶有A和B適配器端的標記。然後用A和B引物進行PCR擴增。

步驟9:然後使用錨定酶來切割小鏈以去除A和B寡核苷酸，並允許小鏈形成長鏈的cDNA，稱為cDNA串聯體，其中每個小鏈被一個錨定酶識別位點分離。

最後，轉化、純化和測序連接的cdna:

第十步:然後將你的連接體轉化為細菌，讓細菌進行複製，形成大量的連接體。

步驟11:最後一步(耶!)是使用您最喜歡的協議隔離您的串聯體。然後使用高通量DNA測序來量化每個單獨的標簽。然後創建一個基因表達譜含有信使rna細胞的原始樣本

你現在是SAGE的法師!希望這對您有所幫助，並關注SAGE第2部分，在那裏我介紹了不同類型的SAGE及其有用的原因。