qPCR標準曲線:獲得優質qPCR數據的關鍵

乍一看,qPCR看起來是一個非常簡單的技術，當它得到優化時，它可以帶來偉大的結果。

然而，為了獲得一致和準確的結果，反映你的樣本中真正發生了什麼，良好的對照對良好的qPCR數據至關重要。

這些關鍵控製之一是qPCR標準曲線。這使你能夠檢查引物的效率。

高效引物對獲得高質量的qPCR數據很重要

設計和測試qPCR引物在做任何qPCR實驗之前，使用標準曲線是絕對必須的!確保獲得的Ct值是有價值的，並反映現實是很重要的。

在你收到新的引物後，你通常會不耐煩地運行你的qPCR以獲得新的結果。但如果你不先測試引物，那麼你可能會得到錯誤的結果，並損失大量時間。沒有研究人員願意冒這個險。

無論你是用生物信息學軟件設計引物，來Bitesiz188bet手机版APPe Bio尋求幫助，或者選擇一個已經發表的序列，你不能保證你的引物是好的。即使熔體曲線的結果是一個漂亮的，幹淨的單峰，這並不表明寡聚物是可用的。在劑量依賴性DNA擴增過程中，它們仍然可能無法有效地擴增靶標。

因此，您應該始終用qPCR標準曲線檢測引物。qPCR標準曲線確保引物與目標物有效而精確地結合並擴增，這是至關重要的。

如何繪製qPCR標準曲線

要執行qPCR標準曲線，你需要建立qPCR反應來擴增不同數量的相同DNA樣本。從理論上講，有效的引物會產生成比例的劑量-反應曲線。

要得到一個好的標準曲線，理想情況下至少需要幾個數量級(5- 10倍稀釋)的5個數據點。

然後，你需要在y軸上繪製得到的Ct值，在x軸上繪製每毫升的log DNA拷貝數。一個標準曲線的例子如下麵的圖1所示。

您還希望以三份形式運行示例，以便評估可重複性。

為了得到精確的結果，在每次反應中進行順序稀釋和吸除相同體積的DNA。用水代替DNA作為陰性對照來檢測反應中的汙染物和區分背景擴增。

同時，要確保你的DNA樣本是高質量的(完整的DNA，適當的濃度和良好的260/280的比例）.

分析你的標準曲線

一些qPCR軟件可以用來分析你的標準曲線。它生成曲線並計算反應效率。在分析曲線時，有幾個值需要計算和評估。

聚合酶鏈反應效率

我們所說的PCR效率是什麼意思?在PCR的理想條件下，DNA分子的數量應該每循環翻一番。這將提供100%的效率，這是我們正在努力實現的目標。反應很少是完美的，因此，可接受的效率範圍在90%到110%之間。

你可能會想，哇，你怎麼能有超過100%的效率?這是可能的，通常表示聚合酶抑製。這種抑製作用在稀釋程度最低的樣品中最強。隨著樣品被稀釋，抑製劑的濃度降低(因為稀釋)，這可能導致效率超過100%。

如果你確實看到效率超過100%，嚐試稀釋你的樣品更多或不包括更高的稀釋在效率計算。

如果數值低於90%，則可能存在抑製劑汙染或底漆效率較差。

如何計算PCR效率

很多qPCR軟件會為你計算PCR效率，但如果你想自己計算，你可以使用下麵的公式:

E =(10 ^{\壓裂{1}{坡}})1

要得到效率百分比，隻需將這個數字乘以100。

R²價值

R²值為相關係數，應為> 0.99，以提供良好的置信度。

這個值可以讓您查看每個樣本的值之間是否存在良好的線性關係。較低的值可能表明序列稀釋程度較差。為了避免這種情況，在進行連續稀釋時，請確保您的移液管準確，使用校準好的移液管，並充分混合稀釋劑。

如何計算R²價值

要手動計算這個值，可以用每個樣本稀釋倍數與平均值的對數繪製一個圖Cq價值．Excel會計算R²值，您可以通過確保在圖表選項中選擇“在圖表上顯示方程”來查看。

Cq值的標準差

執行複製有助於減少錯誤，使您的R²PCR效率值更可靠。但是，如果您的複製變化太多，您將得不到可靠的值。

要檢查複製的可靠性，請計算標準偏差(SD)。好的重複應在0.2 SD單位以內。如果它們不是，你可能需要重做你的標準曲線。

如果你從你的qPCR標準曲線中得到很好的數據，你就會對引物的效率感到滿意!但如果標準曲線數據不太好呢?

如果你的引物效率不高怎麼辦?

令人驚訝的是，qPCR標準曲線的結果往往是不相稱的曲線;每個DNA濃度的結果都是大致相同的Ct值。這意味著引物不能有效地識別目標。

如果這種情況發生在你身上，首先，確保你的DNA樣本是幹淨的，不含汙染物。如果你的引物仍然不能有效地放大，那麼設計並訂購一對新的引物。

在過去，我嚐試解決引物效率低下的問題，以找到合適的參數(引物濃度，退火溫度等)。在我看來，它很少會帶來好的結果。

差的qPCR標準曲線可能反映低的DNA表達

不良的標準曲線可能不是由低效的引物造成的。如果你的目標在樣本中表達不好，你的標準曲線可能是不正確的。你應該驗證這個靶標是否在你正在研究的細胞類型中表達。如果你的靶點表達不好，增加用於擴增的DNA的數量。

或者，你也可以做一個預擴增步驟來增加目標蛋白的表達量，這方麵有商業工具包可用。(1)你也可以在粗細胞裂解物上進行qPCR純化RNA樣品，以避免丟失材料。（2）

qPCR標準曲線的優點

除了知道引物是否有效外，標準曲線還能告訴你檢測限。這可以幫助你確定下一步實驗中使用的DNA的合適數量。當你用1ng就能得到很好的擴增時，為什麼每次反應用10ng呢?這樣你就可以把你寶貴的DNA樣本留給更多的qPCR反應!

總而言之，跳過qPCR標準曲線步驟可能很誘人，但我希望我說服了你花時間評估你的新引物的效率是多麼重要。在開始的時候花點時間來確保你的引物是有效的，從長遠來看可以節省大量的時間，最終導致更好的結果!

最初發布於2016年11月。2022年6月審核並更新。

參考文獻

1. Korenkova V等人(2015)高通量qPCR基因表達實驗背景下的預擴增．BMC雜誌。十六5。
2. 範佩爾G, Mestdagh P, Vandesompele J. (2012)細胞培養裂解物精確RT-qPCR基因表達分析．Sci代表．2:222。