更快的結紮:釘下來的秘密
過夜結紮是不方便的——尤其是當結紮失敗的時候。幸運的是，有一種直接的方法可以加快DNA連接。這篇文章著重介紹了快速結紮反應的秘密成分，並提供了一些使用它的提示和注意事項。有關DNA連接的一般概述，請參見在這裏而且在這裏．
買一個快速結紮工具
進行快速結紮最方便的方法是購買快速結紮工具包，例如以下其中一種:
- Ligafast克隆係統(Promega)
- 快速結紮試劑盒(New England Biolabs)
- 快速DNA連接試劑盒(ThermoFisher)
- DNA連接試劑盒，Mighty Mix (Clontech)
這些套件可以在室溫下進行5至15分鍾的結紮。這些快速結紮反應背後的秘密是什麼?連接反應緩衝液的簡單添加物:聚乙二醇(PEG)。
PEG如何使結紮更快?
聚乙二醇是一種惰性聚合物，大小不一，從低分子量(MW)到大分子量(MW)不等。這就是PEG背後的關鍵:它通過簡單地去除連接反應中的空隙來加快連接反應，這種現象被稱為大分子擁擠或體積排斥。其他擁擠劑(如，Ficoll，白蛋白)發揮類似的作用，但不如PEG的效力。[1,2]通過排除連接反應的體積，可以增加DNA末端的有效濃度，使它們更有可能結合並被連接酶連接。
但是為什麼會這樣呢?有趣的是，擁擠的反應條件更好地反映了細胞內環境，其中許多酶，包括DNA連接酶，內源性運作。因此，這類酶在這種條件下是高效的，特別是與典型結紮反應中發現的人為稀疏條件相比。這種差異在鈍端結紮的情況下最為顯著，鈍端結紮發生的頻率比粘端結紮低得多。
如何使你自己的緩衝更快的連接
買一個快速結紮包可能很方便，但方便通常是有代價的。為了更經濟的解決方案(沒有雙關語的意思)，使用下麵的食譜作為起點:
2倍緩衝更快連接[3]:
- 132mm Tris (pH 7.6)
- 20mm MgCl2
- 2mm DTT
- 2 mM ATP
- 15% peg (mw 6000)
在定製您自己的快速連接反應時，請記住以下提示:
- 高MW peg的使用是至關重要的，因為低MW peg不會帶來任何反應益處。[1]通常使用PEG-6000(3000和8000之間的任何值都可以工作)。
- 不要使用太多(或太少)PEG。從5-7.5%的PEG(最終濃度)開始，避免超過10%。上述配方的最終PEG濃度為7.5%。
- 高濃度的DNA連接酶和二價陽離子(如Mg2+)有利於分子間連接產物的形成。這很好，因為質粒DNA連接首先需要插入物和載體之間的分子間連接。這可能就是為什麼NEB的快速連接緩衝液中含有十倍多的MgCl2比標準的DNA連接酶緩衝液要高。然而，過量的連接酶/陽離子會抑製下一步，即連接產物通過分子內連接環狀化。避免過量的連接酶和二價陽離子。
排除含peg的連接反應
雖然聚乙二醇提供更快的連接反應，它可以降低細菌轉化效率在一定條件下。雖然這一現象背後的機製尚不清楚，但可能是溫度和孵育時間等條件有利於長DNA串聯體的形成，而不是環狀DNA。(2、5)
- 不要讓你的結紮反應超過2小時．一般來說，粘頭結紮需要5分鍾，鈍頭結紮需要15分鍾。
- 不熱滅活．雖然推薦用於某些結紮反應，但含peg反應的熱失活將導致轉化失敗。
- 當你有疑問時，在轉變之前清理你的反應．這可以通過旋轉柱、沉澱或滴析來完成。當使用電穿孔轉化你的細菌時，這是絕對需要的。對於其他轉換方法，可能不需要清理;事實上，聚乙二醇在這種情況下可能會產生輕微的刺激作用。[6]
需要更多關於DNA結紮的技巧?看到在這裏而且在這裏。想要完全放棄結紮?看看這個非結紮克隆方法．
參考文獻
- s·b·齊默爾曼，b·h·菲弗，大分子聚合允許大鼠肝髒或大腸杆菌DNA連接酶的鈍端連接．美國國立自然科學研究院80， 5852-6(1983)。
- s·b·齊默爾曼，b·哈裏森，大分子聚集加速了末端互補的DNA片段的內聚。核酸測定13， 2241-9(1985)。
- 新英格蘭生物實驗室的快速連接試劑盒數據表(PDF)。
- 林K.，中澤M.，石崎Y.，平岡N.，大林A.，在聚乙二醇存在下T4 DNA連接酶對分子間和分子內連接的調控。核酸測定14， 7617-31(1986)。
- D.路易，P.瑟威爾，溫度對長度大於0.04 Mb的內聚端DNA的排除體積促進環化和串聯化的影響．核酸測定19， 3047-54(1991)。
- b·h·菲弗，s·b·齊默爾曼，聚合物刺激連接:在聚合物溶液中通過T4 DNA連接酶增強DNA或脫氧核寡核苷酸的鈍端或內聚端連接．核酸測定11， 7853-71(1983)。