miRNA表達:如何選擇正確的分析平台

2020年3月19日發布

mirna是高度保守的小非編碼rna它們對健康和患病狀態下的一係列過程具有負調控作用，也可作為多種疾病的生物標誌物。這就是為什麼miRNA分析目前具有巨大的生物學興趣和一個快速發展的研究領域。但是，在你開始破譯你的miRNA-of-interest調節一種生物反應，你將需要一個敏感的，可複製的和廣泛接受的miRNA分析平台來測量表達。在本文中，我們將討論在選擇miRNA分析平台時需要考慮的事情以及可用的不同選項。

選擇miRNA分析平台時的注意事項

在設計實驗時，有各種各樣的miRNA分析平台，需要考慮很多因素，從成本到準確性。因此，為你的miRNA表達實驗選擇一個分析平台是令人生畏的。下麵簡要討論一下在選擇miRNA分析平台時需要考慮的問題:

目標:您的目標是獲得miRNA庫的精確總體圖像，理解miRNA成熟的過程，還是深入研究選定的一組miRNA的生物學意義?
動態範圍：您想檢測2-還是2×10⁶-你感興趣的miRNA的變化?
特異性：成熟的miRNAs在19到25個核苷酸之間變化，由較長的前體通過多步生物發生產生。這就形成了一個具有細微差異的異構miRNAs池，這些miRNAs可能調節不同的靶標集。你知道你打算研究miRNA生物生成過程的哪個階段嗎?你知道你的平台是否能夠區分未成熟和成熟的mirna，或者具有非常相似序列的mirna嗎?
分析:您是否有預算/可用性進行廣泛的生物信息分析?a的表達式歸一化了嗎參考基因，這種方法相對較快，但會引起偏見，你能接受嗎?
一次投資：你是需要在幾小時內得到結果，還是可以給幾周時間進行實驗?你有時間學習複雜的分析嗎?

我有什麼選擇?

現在我們來談談你可以用來分析miRNA的平台。每個平台都有自己的優點和缺點，你的選擇最終取決於你在成本、時間、技能、靈敏度、準確性，當然還有可重複性方麵的優先考慮:

1.定量實時聚合酶鏈反應

實時定量PCR (qRT-PCR)是任何基因表達實驗的金標準，也可用於檢測任何成熟階段的miRNAs。在本試驗中，使用特定引物擴增細胞總RNA的非均勻混合物中的miRNAs。

優點

總RNA被方便地用作輸入，因此不需要預分級。
這是太快了。
它被廣泛認為是高度可複製的。

缺點

中存在在擴增過程中使用了你的個別mirna的引物，這意味著你需要知道你在尋找什麼特定的mirna。
在你的實驗設計中可能存在選擇偏差，傾向於預先測序的mirna。
高通量分析具有挑戰性，因為在相同的PCR反應條件下並行分析多個miRNAs是不可行的，因為它們本身會折疊形成發夾結構。

2.Hybridization-Based載玻片微陣列

在過去的幾十年裏，該技術得到了很好的優化，為miRNA分析提供了一個健壯的選擇。在這裏，來自組織或細胞樣本的總標記RNA被雜交到標準玻璃載片陣列，用於你感興趣的物種的所有成熟miRNAs。然後用原始數據計算複雜的熱圖，用於不同樣本之間的比較。

優點

由於miRNAs比典型的轉錄本要小得多，即使是微陣列載玻片上的短寡核苷酸探針也能精確地雜交到目標，從而降低了微陣列生成的成本。更短的miRNA探針也提高了檢測的敏感性和特異性。
隨著新的mirna被發現，定製微陣列芯片在單個芯片上容納了一整套已知的mirna，允許快速和可靠的高通量分析，這些分析已經在更廣泛接受的平台上驗證，如qPCR和Northern blots。

缺點

由於mirna比典型的轉錄本小得多，可能隻包含細胞或組織RNA樣本的有限部分，如果需要精確測量前mirna的成熟程度，可能有必要通過事先的大小選擇來豐富你的mirna樣本。
另一方麵，由於臨床樣本的數量往往有限，提取的miRNA總量往往很小。非特異性擴增可用於增加miRNA樣本，但在測量表達水平時，這意味著您將失去總輸入樣本和所測miRNA數量之間的直接對應關係，從而在分析中引入非線性。

3.新一代測序

下一代測序技術(NGS)在生物學和臨床實驗室中迅速普及，為研究miRNA表達譜提供了另一種方法。NGS包括將適配器連接到樣本RNA上，通過PCR擴增生成cDNA文庫。然後篩選與miRNAs對應的文庫長度，並對齊到合適的參考序列。

優點

識別分析樣本中的所有microRNA分子，不受新microRNA和序列異構體發現率的限製。
它可以是高吞吐量的。
具有自動化的潛力，可以減少手工操作時間和減少手工采樣錯誤。
它可以同時測量表達水平和序列變化。

缺點

它需要大量的時間來表演。
需要在工作流程末尾進行數據分析的熟練人員。[1]
由於放大，測量中可能存在非線性。

4.北部汙點雜交

傳統的北方印跡法檢測非均勻混合物中的特定RNA分子。這種方法包括電泳拆分細胞RNA，將拆分後的RNA吸到膜上，並將標記的探針雜交，以便在x射線膠片上看到你感興趣的RNA。對傳統的Northern blotting協議進行了一些改進，以提供足夠高的分辨率來檢測單個核苷酸的變化和非常短的rna。[２]

優點

它為低豐度miRNAs提供了優越的敏感性和特異性。
它在檢測表達水平的微小變化方麵提供了微陣列所不能提供的優越靈敏度。
預先設計的探針可用於所有miRNA種類，有廣泛的標簽選擇，允許多路複用和共定位分析。
由於樣品在任何階段都沒有被擴增，你可以在總RNA中檢測到miRNA，而不是在人工擴增的混合物中。
由於電泳分辨率，Northern blots檢測miRNA的大小，除了其表達水平。
染色膜可以儲存，剝離和重新探測數年。

缺點

非常耗時。
需要大量的輸入樣本。
通常需要放射性標記來增加檢測總RNA中豐度低的mirna的靈敏度。
它不適於高通量分析，隻用於評估一個或少量的miRNAs。

5.核糖核酸酶保護分析

這個實驗背後的想法利用了一個奇怪的事實，即RNase酶隻切割單鏈RNA，而保留雙鏈RNA完好無損。標記的總RNA樣本與它們的miRNA補體探針雜交，用RNase孵育以切掉未雜交的單鏈RNA，在聚丙烯酰胺凝膠上分解，並在膜上印跡，以檢測與探針結合的相應標記的miRNAs的信號強度。[3]

優點

為低豐度miRNAs提供優越的敏感性和特異性。
預先設計的探針可用於所有miRNA種類，有廣泛的標簽選擇，允許多路複用和共定位分析。
由於樣品在任何階段都沒有被擴增，你可以在總RNA池中檢測到你感興趣的mirna，而不是在人工擴增的混合物中。

缺點

非常耗時。
需要大量的輸入樣本。
通常需要放射性標記來增加檢測總RNA中豐度低的mirna的靈敏度。它不適於高通量分析。
必須知道要檢測的miRNA的序列。

盡管Northern Blotting和RNase Protection Assay存在局限性，但它們經常被用作輔助協議來確認通過其他方法獲得的結果。

6.基於納米技術的miRNA分析平台

這些都是最近的創新，主要還處於研發階段。這些方法利用設計好的納米孔——分子尺度的孔——及其電導特性來檢測納米孔內選擇性單個miRNAs分子的位置和構象。

優點

提供有關miRNA計數、長度和構象的敏感、具體、定量和無偏倚的數據。
它不需要標記、結紮、反轉錄,或放大。[4]

缺點

目前還沒有上市。

miRNA分析平台綜述

平台	時間	輸入	成本	筆記
存在/微流體	< 6小時		500/10ng	< 400美元	對已知miRNAs的高通量、自動化分析;驗證性試驗;對內參基因表達進行歸一化分析
微陣列	~ 2天	100年ng-1µg	~ 300美元	高通量;概要文件的microrna;對內參基因表達進行歸一化分析
總會在	1 - 2周	500年ng-5µg	> 1000美元	所有microrna概要;高通量;相當大的生物信息學分析
Northern blot/RNase保護試驗	> 1周	20µg	< 800美元	高示例輸入;概要文件的microrna;耗時;艱苦的
納米孔方法	< 3小時		~ 1µg	實驗	目前還沒有上市;承諾敏感、具體和無偏見的miRNA分析。

表1:miRNA分析平台的比較

綜上所述，如果你堅持傳統，並決心使用手工協議和你可以賭上你的生命的手工試劑，你可以選擇傳統平台，進行RNase保護試驗或Northern blot來測量你的樣本中的miRNA表達水平。如果不是這樣，你可以選擇目前研究文獻中的黃金標準，並進行定量實時PCR。如果你擔心更傳統的方法存在偏差，並且手頭有時間和資金，你可以投資優化基於納米技術的分析方法。

說了這麼多，做了這麼多，在成本，便利性，精確度，準確性和樣品可用性之間取得最佳平衡優化最適合您的方法，您需要非常仔細地考慮每個分析平台的優缺點。

引用:

Kolanowska M,等．(2018)使用下一代測序的MicroRNA分析．方法雜誌．1823:87 - 101。DOI: 10.1007 / 978 - 1 - 4939 - 8624 - 8 - _8。
Koscianska E,等．(2011)微RNA、其前體和RNA幹擾觸發器的Northern印跡分析。BMC分子生物學．12:14。DOI: 10.1186 / 1471-2199-12-14
Yamamura年代,等．(2012)熒光標記核蛋白探針微芯片電泳檢測細胞培養中的miRNA．傳感器(巴塞爾)．12(6): 7576 - 7586。DOI: 10.3390 / s120607576
顧LQ,等．(2012)用納米孔單分子計數器檢測miRNAs．專家Rev Mol診斷．12(6): 573 - 84。DOI: 10.1586 / erm.12.58。

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寫的Anjali a人形