五種修改siRNA以改善RNAi的方法

盡管CRISPR/Cas基因組工程越來越受歡迎，RNA幹擾(RNAi)仍然是生命科學家工具箱中廣泛使用的工具(複習一下RNAi的機製)．事實上，RNAi最近在Patisiran的批準下進入了臨床，Patisiran是一種基於sirna的治療遺傳性轉甲狀腺素澱粉樣變相關的罕見神經病變的藥物。[1]如果沒有發現和優化提高siRNA功效的化學修飾，這樣的壯舉即使不是不可能，也會困難得多。化學修飾越來越受到研究人員的青睞，以提高sirna的核酸酶耐藥能力和傳遞，同時減輕其免疫原性(即，它們引發免疫反應的傾向)。

為了說明sirna的化學修飾類型，我們先來看看RNA的基本結構。圖1描繪了兩個核糖核苷通過磷酸二酯鍵連接在一起。顏色顯示的是可以被化學修飾的位點。其中包括磷酸二酯主鏈上的非酯基(橙色)、堿基(品紅)、糖(綠色)和5 ' /3 '共價修飾(X，藍色)。這是對sirna進行化學修飾的五種方法(最後一種計算了兩次，以說明不同類型的結合)。

1.目的地修改

化學修飾siRNA最常見的方法是通過磷酸化的反義鏈的5 '端Argonaute 2 (Ago2)是介導RNAi的RISC (rna誘導沉默複合物)機製的關鍵組成部分。然而，如果你自己沒有磷酸化這個關鍵部位，不要煩惱;細胞會替你做的。盡管需要注意的是，通常情況下，高度修飾的sirna會對細胞內激酶產生不良底物，[3]是一種障礙，可以通過使用不能水解的5 ' -磷酸類似物(如5 ' -(E)-乙烯基膦酸鹽)來克服。[4]

2.骨幹的修改

修飾連接連續核糖核苷的磷酸二酯基團已被證明可以增強穩定性和在活的有機體內sirna[4]的生物利用度。非酯基(-OH， =O;圖1中橙色的)的磷酸二酯鍵可以被硫、硼或醋酸鹽取代，得到硫代、硼磷酸鹽和磷酸醋酸鹽鍵。

硫代膦酸鹽、硼磷酸鹽和磷乙酸酯連接穩定sirna，因為它們不太容易被外切酶和內切酶水解。然而，需要謹慎使用硫代膦和醋酸膦連接，因為它們會通過抑製sirna加載到RISC機製中來削弱sirna的效力。它們還可以使sirna更容易與免疫受體結合，使其更具免疫原性。另一方麵，[5]硼磷酸鹽鍵很難用化學方法合成。[4]

用磷酸三酯取代磷酸二酯基團有助於細胞吸收sirna並通過消除其負電荷而保留在血清成分上。這對於在活的有機體內siRNA的遞送，因為它增加了siRNA在循環中的半衰期。此外，這種修飾有效地將小幹擾核糖核酸[sirna]轉化為小幹擾核糖核酸中性[sirna]，因為第三酯的加入消除了連接的負電荷。一旦進入細胞，酯酶就會去除第三酯，將siRNNs轉換回sirna。[7]

3.糖的修改

當核糖被去質子化(由外切酶和內切酶催化)時，2 ' -羥基(2 ' - oh)基團(圖1中綠色部分)可以充當親核試劑，攻擊相鄰的磷酸二酯鍵中的磷。這就是為什麼修改磷酸二酯鍵可以提高sirna的穩定性——通過保護它們免受鄰近去質子化糖的親核攻擊。

不需要修改磷酸二酯鍵使其不容易受到親核攻擊，核糖上的2 ' -羥基可以通過用不太親核的東西(即不太可能提供電子)來取代它。此類替代品包括2 ' - o -甲基、2 ' - o -甲氧基乙基和2 ' -氟修飾。此外，由於其吸電子特性，這些修飾也會影響核糖糖的構象，這一效應可以增加siRNA雙工的結合親和力。連接呋喃糖環的2 '和4 '位置——被稱為鎖定核酸——對siRNA的結合親和力表現出類似的作用。然而，在RISC加載過程中加入太多這樣的修飾會抑製siRNA雙工的分離。[4]

總的來說，糖修飾比主幹修飾更常見，因為它們不影響RISC對siRNA的識別。[8]

4.基礎上修改

免疫細胞可以將外源rna與“自身”rna區分開來，因為外源rna缺乏哺乳動物細胞中自然發生的化學修飾。這包括糖修飾(圖1中用洋紅色表示)，如2 ' - o -甲基，以及用修飾過的堿基取代堿基，如假尿嘧啶、5 ' -甲基胞苷、n6 -甲基腺苷、肌苷和n7 -甲基鳥苷。因此，修飾這些位點的sirna可以使它們逃避免疫檢測，[9]，但也可以降低它們的沉默效力。[10]

5.脂質結合

與其他修飾不同的是，脂質可以結合到siRNA的5 '或3 '端來改善它們的修飾在活的有機體內通過使它們與血清脂蛋白結合來獲得生物利用度。例如，在靜脈注射時，膽固醇和維生素E結合顯著增強了肝髒和其他組織對siRNA的吸收。其他脂肪酸，即棕櫚酸酯和生育酚，在小鼠中被證明毒性較小，同時保持基因沉默活性。[11]

我應該使用修飾過的sirna嗎?

雖然對很多人來說不是必需的在體外在應用中，化學修飾的sirna通常比未修飾的sirna表現得更好。在我的經驗中，化學修飾的sirna的增強穩定性有效地降低了實現足夠的基因敲除所需的sirna濃度。這一點很重要，因為高濃度的siRNA會導致脫靶效應[12](一般來說，您應該隻使用足夠多的siRNA，以充分沉默您的目標)。大多數在活的有機體內另一方麵，由於相關的挑戰，應用絕對需要化學修飾的sirna在活的有機體內RNAi(例如，生物利用度和細胞攝取)。

值得慶幸的是，許多商業供應商-ThermoFisher，踴躍參與，Millipore-Sigma,地平線上發現例如，通過提供穩定性和效力優化的經過化學修飾的siRNA，來消除對siRNA優化的猜測。您可以合成自己的修飾過的sirna，但請記住，這可能需要在過程的每一步進行廣泛的優化。

無論你是從商業上獲得siRNA還是自己合成siRNA，化學修飾必須保持平衡，以不降低基因沉默的效力——畢竟，一個高度穩定的siRNA隻有在能夠沉默其預期目標時才是好的。

參考文獻

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