準備中期傳播:分解細胞上的分解
細胞遺傳學是遺傳學的一個分支，致力於研究染色體。染色體不穩定性和染色體重排在基因組被用來診斷和定義幾種遺傳疾病，甚至一些癌症。[1, 2]研究人員使用多種技術來識別染色體的結構，包括熒光原位雜交(FISH)、核型分析、流式細胞術和比較基因組雜交(CGH)。
即使你不是一個細胞遺傳學家，你可能需要評估某些細胞係的染色體不穩定性，例如，在你將它們用於你的論文項目之前(特別是如果你使用胚胎幹細胞)。(3、4)
評估染色體不穩定性或染色體重排的第一步是收集染色體，它本身可以是一種藝術形式。
準備中期擴散的第一步
首先，你的細胞需要運轉80%融合(健康!)，然後再收割。如果你沒有足夠的細胞，你可能沒有足夠的染色體來進行進一步的分析。
阻止細胞周期
下一步是阻止細胞周期。捕獲細胞周期的中期對於研究染色體是至關重要的，因為這是它們最濃縮的一點，便於觀察。一些常見的中期阻滯藥包括秋水仙堿、去黴素、長春堿和諾可達唑。(5、6)
脫毒黴素，或秋水仙，是最常見的化合物，用於阻止中期擴散的細胞周期。[7,8]秋水仙堿是秋水仙堿的合成類似物，具有劇毒作用。[9,10]長春堿和秋水仙堿一樣，是植物中發現的一種天然化合物，但也被證明會影響DNA合成，這很可能是它不用於中期擴散的原因。(11、12)
所有這四種化合物都通過破壞微管的穩定來阻止細胞中期，從而阻止紡錘體組裝並激活紡錘體組裝檢查點。[5,6]當與任何這些化合物孵育時，細胞將無法進入後期。
收獲的時間
一旦你在中期捕獲了你的細胞，是時候開始收獲了!這幾乎與收集細胞顆粒的工作方式相同，隻是你將用秋水仙堿保留介質，而不是倒掉它。將含有秋葵堿的培養基倒入錐形管中，然後對細胞進行胰蛋白酶處理。一旦細胞分離，用保存的添加了秋水仙堿的培養基稀釋胰蛋白酶。用離心機分離細胞，除去上清液，你就會得到一粒中期阻滯細胞。
這是第一個棘手的部分:讓細胞變得脆弱。對於中期擴散，我們需要破壞細胞膜來幫助觀察染色體。這些細胞需要很脆弱，這樣當它們落在顯微鏡載玻片上時就會破裂。
要做到這一點，我們需要向細胞中加入低滲溶液，它的溶質濃度相對於細胞內部較低。這導致滲透梯度在細胞的外部和內部之間形成。因此，添加低滲溶液會導致細胞膨脹，使它們非常脆弱。你可以把這些細胞想象成水球:你希望它們足夠滿，這樣當它們碰到什麼東西時就會破裂，但又不能滿到在你手裏破裂!
達到這種平衡的最簡單的方法是一次加一點點低滲溶液，而不是一次加全部溶液。這樣，你就可以緩慢地重新懸浮你的細胞，使其均勻腫脹。你要確保你的試管裏沒有細胞團。輕輕敲一下試管，應該可以打破任何不想要的細胞團。中期擴張期最常見的低滲溶液是氯化鉀，但一些方案使用檸檬酸鈉。(13 - 15)
有這種想法
一旦細胞在低滲溶液中孵育，你要把它們固定在這種腫脹的狀態，這樣它們就可以儲存起來以備將來使用。甲醇和醋酸的組合似乎是染色體收集最常見的固定方法。單獨使用甲醇等酒精會導致細胞萎縮。加入醋酸會導致腫脹，使細胞保持在不太腫脹的狀態。你可以將這些細胞作為一個小球在4°C保存一年或直接進行下一步。［7］
準備的幻燈片
將中期染色體擴散到載玻片上是染色體收集過程中最困難的部分，關於哪一步對最終擴散影響最大存在很多爭議。
一旦你準備好做中期擴散，在新鮮的固定劑中重新懸浮你的細胞球幾次。這將有助於去除任何細胞團塊，然後再把它們放到幻燈片上。
訣竅是讓重力為你工作，但你可能需要花一些時間來優化距離。如果你的載玻片和移液管之間的距離太大，你的染色體就會分散得太遠。當染色體距離太遠時，可能很難確定它們是來自一個細胞還是兩個細胞。這可能是一個巨大的問題，如果你試圖評估你的細胞倍性。[16]
如果你的移液管和你的移液管之間的距離太小，你的染色體就會重疊並擠壓在一起。當你的染色體重疊時，你將無法區分它們。這將使任何染色你可能很難評估。使用一次性移液管將細胞滴到幹淨的載玻片上，但要記住，移液管的直徑也會影響載玻片上的染色體擴散。
濕度是中期擴散過程的一個重要組成部分，它似乎是影響染色體在載玻片上擴散的最重要因素。這種固定劑會從空氣中吸取水分，從而使受損的細胞重新水合。控製這個複水過程是美麗中期蔓延的關鍵!
兩種最常用的保持滑道濕度的方法是:
- 將細胞放入玻片上之前，先將玻片浸入水中或預先冷凍，使其稍微濕潤，然後用熱塊烘幹。
- 使用幹燥的載玻片，放下細胞，然後立即將載玻片放在有蓋水浴的托盤上。
方法的選擇取決於個人，但總的信息是保持濕潤!
當幹燥載玻片時，根據不同的協議，溫度可以從20°C到75°C不等。[6,7,13,18,19]較高的溫度會導致固定劑幹燥過快。溫度過低可能會導致你的幻燈片上的水分增加，因為冷空氣不能像暖空氣那樣容納更多的水。這可能會導致你的定影劑幹得太慢。由於幹燥時間會影響染色體的擴散，所以找到合適的溫度和濕度組合以優化細胞的染色體擴散是很重要的。[17]
關於中期傳播準備的最後思考
一旦你的幻燈片幹燥，染色體固定在合適的位置，它們就準備好了下遊應用，如免疫染色．在準備下一張幻燈片之前檢查一下你的第一張幻燈片可能會有幫助。這樣，你就可以根據你在顯微鏡下看到的染色體擴散情況，對你的方法做出任何調整(比如距離、濕度和溫度)。
最重要的是，請記住，完善你的中期擴張是一門藝術!循序漸進地遵循協議是一個很好的開始，但是您需要根據需要優化您的方法。如果您需要一個可視化協議或一些故障排除技巧，請查看培養細胞的染色體製備由豪等．［5］
你有什麼解決染色體問題的方法嗎?請在評論中告訴我們。
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