二維凝膠電泳是如何工作的?

二維凝膠電泳(2D gel electrophoresis, 2DE)是一種基於等電點和分子量從複雜樣品中純化單個蛋白質的關鍵技術。理論上足夠簡單，但作為過剩協議而且文章可見，2DE需要耐心和細致的優化。但無論你的樣品是人類血清還是HUVEC裂解物，2DE都使用這四個核心步驟:樣品溶解、等電聚焦(IEF)、sds - page，然後——呼!——分析。

步驟1:樣品溶解

很像常規的ol ' SDS-PAGE，那些用於2DE的組織或血液樣本需要處理和溶解，然後才能裝入IEF凝膠。在理想的情況下，所有的蛋白質都能立即溶解而不發生質量或數量上的變化。在現實世界中，並不是所有的蛋白質都是相同的，這第一步立即使2DE傾向於檢測高可溶性和豐富的蛋白質。但是，不要伸手去拿tweween和Triton;增溶需要ief兼容的裂解試劑，如電中性洗滌劑(如CHAPS)和尿素等超溶物。令人討厭的是，尿素可以氨甲酰化蛋白質，而那些討厭的清潔劑會幹擾下遊步驟!因此，這一步需要大量特定於樣本的優化，以避免偏差和汙染。

第二步:等電聚焦

最後，你的樣品被溶解了!是時候將其加載到IEF凝膠上了，類似於SDS-PAGE，蛋白質將在電場的作用下通過丙烯酰胺凝膠。IEF更令人興奮的地方是凝膠包含了pH梯度，每個蛋白質隻移動到它的等電點(pI)。的π為蛋白質不帶淨電荷的pH值，這意味著電場對蛋白質沒有影響，蛋白質保持不變，在其pI的0.01 pH單位內緊密聚焦在一個帶內。盡管這聽起來很簡單，但IEF給科學工作帶來了一些麻煩。首先，蛋白質變得不易溶解，甚至會在接近pI時析出，尤其是在低鹽、ief友好的緩衝液中。其次，IEF凝膠和緩衝液幹擾質譜(MS)樣品準備，很難染色分析。這意味著必須首先執行IEF，以便SDS-PAGE能夠使示例與ms兼容。最後，角蛋白很容易汙染你的樣本，所以這一步需要手套，勤奮脫毛，並在“噴嚏屏蔽罩”後麵工作。

步驟3:sds - page

最後，第二次元!但首先，那些漂亮聚焦的蛋白質需要在SDS中再次溶解，然後它們才能在正交的第二軸上被分子量分離。除了這種平衡和對時間和電壓的一些額外的關注之外，這一步使用分子量通過可靠的方法分離蛋白質sds - page方法．最後，凝膠將使蛋白質沿著兩個軸排列:等電點和分子量。

步驟4:分析，或步驟1:質譜準備

最後一步取決於你特定的實驗終點:你是在比較蛋白質表達嗎?和/或識別蛋白質?當比較蛋白在不同實驗樣品中的表達時，凝膠通常是總蛋白用銀或考馬斯藍染色．然後使用各種圖像分析平台掃描和比較分離蛋白的位置和強度。自然，分析不像把凝膠放入掃描儀那樣幹淨和簡單。為了提高樣品之間的可重複性，凝膠應該並行運行，這可能會導致後勤和外交挑戰，在一個隻有一個電源供應和即將到來的實驗室會議。此外，要解釋摩爾斯式的點和點的模式，需要事先對蛋白質進行識別和注釋，要麼通過內部努力，要麼通過甜蜜的注釋相似樣本數據庫．

對於處於蛋白質鑒定階段的患者，一般有兩種選擇。首先是進行蛋白印跡，將蛋白質從sds - page凝膠．第二種方法——更強大、更費力、更昂貴——是切除凝膠中的蛋白質，消化它們，然後將它們送去進行ms鑒定。這可以產生大量高分辨率的信息——例如，蛋白質翻譯後修飾或與疾病相關的加合物的類型，這足夠令人驚訝了!-樣本要符合ms標準，有嚴格的要求。通常需要清理步驟來去除洗滌劑和蛋白質汙漬，而一些汙漬——尤其是銀漬，通常需要用甲醛溶液顯影——會幹擾MS樣品的製備。此外，MS通常需要每個樣品幾百納克的蛋白質，這意味著你感興趣的蛋白質必須能被不太敏感的考馬斯藍染色劑看到。

還有其他選擇嗎?

絕望的研究人員已經找到了2DE的幾種替代品。為了純化用於質譜分析的目標蛋白，如果(很大的如果!)目標已知且單克隆抗體可用，可以使用基於抗體的珠分離係統(如Dynabeads)。一些科學家也用酶譜圖代替IEF步驟，但這需要使用已知的酶和它的既定底物之一。

2DE是一種令人生畏的技術，但並不孤獨!如果您正在考慮使用這種方法，我建議您閱讀下麵的一些參考資料，特別是注釋數據庫的特定樣本通過2DE。時間是寶貴的，沒有必要重新注釋輪子(或至少，HepG2裂解物)。

參考文獻

拉比洛德;勒隆;蛋白質組學中的二維凝膠電泳:教程．J蛋白質組學．2011;74(10): 1829 - 1841。

二維電泳．Bio-Rad網站。

蛋白質電泳概述．Thermo Scientific網站。

樣品製備．斯克裏普斯代謝組學和質譜分析中心網站。