使用BLAST的三個提示(和兩個技巧)

基本局部對齊搜索工具(BLAST)算法是通過國家生物技術信息中心(NCBI)提供的一套免費在線資源的核心。雖然大多數研究人員都知道BLAST是一個序列對齊工具，但NCBI的BLAST套件提供了更多!我將深入介紹如何使用這些資源來定位基因中的單核苷酸多態性(SNPs);用Primer-BLAST設計底漆;驗證引物目標。

提示一:如何找到snp

鑒於snp在疾病和研究中的重要性，NCBI提供了工具來整理基因的報告snp。要找到snp，從NCBI開始主頁然後在搜索欄中輸入你感興趣的基因。選擇單核苷酸多態性從所有數據庫搜索欄左側的下拉菜單，如下圖所示:

接下來，選擇淺紅色VarView按鈕下麵的任何一個你的結果:

這應該會在您的查詢基因中顯示已報告和注釋的SNP，如果您正在設計用於SNP基因分型或克隆重組酶的引物，就會用到它。

技巧之一:需要過濾結果，以便您隻查看臨床相關的結果?去那個標著過濾器在蘇格蘭民族黨名單的右邊觀察到的變化．選擇過濾器選項後，一定要點擊刷新按鈕。

技巧二:如何設計引語

NCBI提供Primer-BLAST用於根據查詢序列自動設計引物。要開始設計引物，請訪問爆炸的主頁然後向下滾動到Primer-BLAST選擇下專門的爆炸．通過剪切粘貼的方式輸入你的目標序列，或者，如果它在NCBI的數據庫中列出，作為登錄號。我將在下麵介紹一些自定義選項，但在這一點上，您可以生成引物，而無需進行任何額外的自定義!

範圍:在輸入序列的方框右側，您可以指定從序列開始的精確範圍(編號為5 '到3 ')，用於設計正向和反向引物的靶標。

使用我自己的正向引物(5 ' ->3 '正鏈):如果你已經設計了你的引物，並希望引物- blast提供一些分析(例如T_米)。

PCR產品尺寸:此處設置PCR產物可接受的長度範圍。

返回引物的數量:這設置要考慮的引物候選集的首選數量。注意，這並不是一個保證，特別是當你的參數太嚴格或無意義的時候(例如，你在PCR產品尺寸不會超過500bp，但會低於範圍您隻需考慮間距大於1 KB的引物)。

底漆熔化溫度:這允許您指定T_米(要快速了解融化溫度，請查看我們的提示qPCR而且常規PCR引物設計)。

外顯子結跨度:如果你想排除基因組DNA(其中外顯子被非編碼內含子分割)，那麼設置為引物必須跨越外顯子-外顯子結．

特異性檢查:除非你希望Primer-BLAST返回偏離目標的引物(一般不推薦!)，保持選中並指定生物你們的樣品來自哪裏數據庫來使用，這取決於你的目標是mRNA還是gDNA等等。通過啟用特異性檢查，Primer-BLAST將排除可能放大目標序列之外的東西的引物。

剪接變體處理:如果你選擇這個選項-隻有當你工作的mRNA序列可行-然後Primer-BLAST將不排除可能擴增的引物對多個你目標的mRNA剪接變體。然而，這並不意味著它將提供包含所有已知拚接變體的引物對!你隻是放鬆了你的目標標準。

一旦您輸入了您的序列並根據需要自定義，向下滾動到頁麵底部，在檢查之後使用新的圖形視圖,點擊把引物．這將返回一個地圖，顯示所建議的引物對將在哪裏放大你的目標，以及對引物的分析:它們的長度、精確位置、各自的Tm、GC%和反映自我互補的得分(0.00表示沒有預測的互補)。

提示三:如何預測引物目標

你怎麼檢查你的引物是否擊中了目標?去Primer-BLAST．在查詢框中，輸入您的正向引物(5 '到3 ')。現在輸入一行20個N，將引物分離成單獨的、不重疊的對齊。在N之後，輸入反向引物(也是5 '到3 ')，如下所示:

現在，您應該指定將對哪些數據庫使用BLAST引物。你的目標是人類基因和人類DNA嗎?然後下數據庫檢查人類基因組+轉錄本．然而，你的選擇並不局限於這些人或老鼠;如果使用不同的樣本——例如，未確認的腸道細菌——選擇其他(nr等)。從這些選項下麵的下拉菜單中選擇你的數據庫(以腸道細菌為例，16S核糖體RNA序列)．如果您正在研究人類或老鼠以外的單個物種(例如，大鼠或兔子)，請在下麵的前三個選項中進行選擇其他數據庫：核苷酸集合，參考RNA序列(適用於RT-PCR引物)參考基因組序列．

一旦你得到你的結果，檢查它們的某些組合。如果你的前引物在前鏈上對齊(注釋鏈+ / +）而且你的反向引物對齊到相同的命中，但在反向鏈上(鏈+ / -)，那麼你的引物可能會放大這種衝擊。

技巧2:你的結果是否包括不太可能汙染你的PCR樣本的東西，如橄欖狒狒和尼安德特人?如果你研究人體樣本或者鼠標樣本，確保你在下麵指定了數據庫．或者，也可以排除特定的物種。

參考資料和其他資源:

爆炸技巧。2007。NCBI。< http://www.ncbi.nlm.nih.gov/feed/rss.cgi?ChanKey=blasttips >

常見問題。NCBI BLAST的幫助。

BLAST序列分析工具。2003。

DW山。使用基本本地對齊搜索工具。2004。冷泉港協議。

惠勒D和Bhagwat M. BLAST快速入門。2007.胡瑪納出版社公司。