關於限製摘要的提示:設計限製屏幕

限製摘要很簡單。但如果低估了它們，後果自負。限製消化是分子生物學中許多過程的基石，因此正確處理它們，並知道如何判斷它們是否出錯，是一項基本技能。限製屏幕這是一種簡單而有效的方法，可以確定你的克隆是否包含你想要的插入。載體和插入可以包含許多不同的酶切位點，這使得在設計酶切篩選時，選擇產生可解釋結果的酶切變得令人困惑。再加上並非所有的限製性內切酶都是一樣的(有些酶在使用時可能會有問題)，設計限製性內切篩選可能是一項艱巨的任務。

本關於設置和排除限製屏幕的快速指南將告訴您需要了解的內容。

設計限製屏幕的逐步指南

步驟1。列出可用酶的清單

每個實驗室技術人員和他的狗都有一些限製性內切酶可以使用，所以為什麼不使用這些限製性內切酶呢?(按字母順序)寫下你可用的限製性內切酶的清單(可以是你的個人庫存，實驗室庫存，或者其他實驗室的庫存，如果你們關係足夠友好的話)。找出任何可能有害的限製性內切酶，並盡量避免使用它們(我在它們旁邊標了星號*)。有問題的酶可能是:

• 被甲基化抑製，比如XbaI。
• 需要在37度以下的溫度下孵化^oC.例如，BslI需要55℃的孵化溫度^oC，而smi需要25℃的孵化溫度^oC.你可以在上麵找到孵化溫度的詳細信息NEB的限製性內切酶圖．
• 或者隻是因為某種原因對酶不友好。

步驟2。確定插入內容中的站點

識別插入中的限製位點。NEBcutter V2.0是一種免費且非常方便的工具，可以用來快速識別DNA序列中的限製性位點。如果你能在你的插入中找出兩個位置，在消化後產生一個大小合適的帶，那就太好了，因為這將通過包含一個僅插入帶來增加屏幕的功率。

步驟3。在你的向量中識別站點

查看插入中使用的限製位點是否也存在於向量中，並確定將產生多大大小的帶。然後在載體中選擇盡可能多的限製位點，以消化MCS的5 '和3 '側的載體和載體周圍的載體。選擇將在限製屏幕中產生大尺寸、可識別的條帶的限製站點。

步驟4。執行限製篩選

試著屏幕!希望它能起作用。如果沒有，分析為什麼它可能沒有起作用;回到您的計劃中，找出克隆中可能出現的站點，以獲得您所獲得的結果。建議用不同的酶進行第二次篩選，以確認第一次篩選的結果。

希望這個過程能讓你看到更好、更有信息的限製屏幕，這樣當障礙出現時，你就可以直接跳過它，繼續你的克隆後快樂之路。

故障排除限製屏幕

由於各種原因，限製摘要可能產生不希望的結果或失敗。如果你的摘要給了你意想不到的結果或者根本沒有結果，這裏有一個清單供你參考:

• 限製性內切酶失去了活性。這可能是由於年代久遠，反複凍融或儲存不當。分別檢查每種酶(如果使用多種酶)與陽性對照(如你知道的載體應該給你帶)。
• 限製性內切酶被甲基化阻斷(當某些限製性內切酶的識別序列被甲基化時，它們就會被阻斷）.
• 酶的培養溫度不正確。仔細檢查酶的孵育溫度NEB的限製性內切酶圖．
• 使用了不兼容的緩衝區。NEB的限製性內切酶圖還提供兼容緩衝區的詳細信息。某些緩衝液中某些酶的活性可降低。當使用多種酶時，需要確保緩衝液中所有酶的活性都達到可接受的水平。
• 反應中有太多的DNA或太多的酶(這就產生了梯子)。
• Vector或insert被刪除。
• 不完全消化(酶沒有完全發揮作用)。
• 添加或刪除限製站點。
• 載體製劑是髒的，可能含有抑製消化反應的汙染物。如果你擔心這個問題，可以重新進行準備(如迷你準備)。
• 過多的酶，高離子強度或高甘油會導致星形活性(星形活性是酶裂解位點與標準裂解位點相似但不完全相同的地方。
• 這個克隆其實是負麵的，該死!

當限製性篩選失敗時，一個好的做法是用一組不同的酶建立另一個消化。希望你在設計限製性篩選時已經做了筆記，並且有了可以使用的替代酶的想法。就像沒有早餐咖啡的主管一樣，限製屏幕有時很難解釋，而第二套表帶可以真正幫助了解發生了什麼。

當克隆在限製篩選中失敗時，重要的是要質疑您的數據，並確保您知道它真的是一個負麵影響。有時候，看似消極的克隆實際上是積極的，克隆之神隻是在玩硬球(或者有人在你不知情的情況下拔掉了你冰箱的插頭，破壞了你體內的酶)。

盡可能設置信息最豐富的摘要，並仔細檢查上麵的檢查清單，這將有助於您做到這一點，並可以避免重複相同的錯誤或在已經擁有所需的克隆時重新克隆插入，從而節省寶貴的時間和資源!

你對進行限製檢查有什麼建議?

最初發表於2008年8月11日。2020年1月7日更新並修訂。