遠離(紫外線)光

如果你用紫外線來觀察你以後想要克隆的DNA，這個故事可能會讓你感到恐懼。如果你有膽量，請繼續讀下去。

不久前，我在做一個項目，我必須做一個質粒突變庫。有很多方法可以做到這一點但我覺得我會很聰明紫外線是致突變的-為什麼不直接把質粒放在透光器上一段時間呢?這應該會引入一些突變，並使我的庫變得最小。

這是一個合理的想法，但結果真的讓人大開眼界。

我將等份的質粒放入UVettes(不吸收紫外線的塑料試管)中，並將等份的質粒暴露在302nm的紫外線下，時間分別為0、15、30、60、120和180秒。然後，我將每種樣品的1微升轉化為活性細胞，並鍍在選擇性板上。

我希望看到一個“殺傷”曲線，我獲得的轉化子的數量會下降，因為隨著質粒的紫外線曝光增加，抗生素耐藥盒或複製原點的損傷會增加。然後我會在曲線中間的某個地方選擇一個曝光時間——一個造成足夠但不太大傷害的時間——來做真實的事情誘變．

我畫的曲線是對的，但結果更像是一條平線。

左邊的圖表顯示了我的結果。正如你所看到的，即使15秒的暴露也足以消滅20%的可轉化質粒，到60秒時，轉化效率降低了100倍。

好的，這是302nm的波長——比你通常用來觀察你以後想要使用的DNA的波長更短，因此更具破壞性——但我發現質粒在這麼短的時間內所遭受的破壞程度令人震驚。

記住,用於克隆的DNA片段在某種意義上，它們比質粒更脆弱，因為紫外線不僅會破壞質粒的抗性盒/起源，而且會破壞DNA末端，這會破壞你的實驗。

所以，我相信你能明白為什麼這讓我大開眼界。像許多人一樣，我經常使用紫外線來觀察限製性消化帶，然後在克隆實驗中提取和結紮。而且，像許多人一樣，我想知道為什麼它經常不起作用。但現在答案似乎很清楚了——我知道紫外線是有害的，但我沒有意識到這一點那破壞!

我很快就放棄了使用溴化乙錠來製備凝膠亞甲基藍，可見範圍菌株,而不是。這工作得很好——我的克隆效率立即提高了。這是一個便宜的解決方案，但它的程序是相當耗時的，因為它需要長時間培養在汙漬。

如果你想減少染色時間(警告:這意味著喝咖啡休息的借口更少)，你可以使用sybr安全的染料，可以在非紫外線下可見。SYBR-safe比EtBr更昂貴，使用它需要一個藍色燈箱的初始費用，但它和EtBr一樣靈敏和快速，不需要破壞紫外線。(注意:我不相信EtBr的整個恐怖故事，但出於純粹的實際原因，sybr安全是製備凝膠的一個很好的選擇。)

或者，如果你打算遠離(紫外線)光，而且錢不是問題，你可能想要在凝膠係統的勞斯萊斯裏做這件事表達載體的CloneWell．CloneWell凝膠是預先鑄造的(所以更沒有理由喝咖啡休息)，並且含有sybr安全成分。使用內置的藍光電子凝膠支架，你可以實時觀察你的DNA遷移，但CloneWell係統最好的地方是，凝膠的中間有一個孔，你可以用來收集你的片段，而不需要提取凝膠。所以沒有紫外線和凝膠萃取，聽起來很不錯。

所以，無論你使用哪種方法來進行DNA可視化，我都絕對建議你看到光和不使用紫外線製備凝膠。

你用什麼來進行DNA可視化?

照片:詹姆斯節儉