如何在實驗室進行RNA質量控製:3個關鍵考慮因素

了解什麼是RNA質量控製，為什麼它對你的實驗如此重要，以及如何進行它。

後廣泛的提取程序被嚴格遵守，你終於有了你的RNA。現在怎麼辦呢?下遊應用的成功，比如微陣列，RNA-seq,實時定量PCR，依賴於高質量、完整的RNA．

因此，在開始實驗之前，進行一些RNA質量控製，以確保你有一個完整的RNA製劑，濃度和純度都是正確的，是值得的。

細胞中的RNA質量控製是什麼?

首先，哺乳動物細胞中的RNA質量控製可能與我們在這裏提到的完全不同。[1]細胞中的RNA質量控製是主動監測RNA分子完整性的受控過程。特定的RNA質量控製機製存在，以控製任何異常RNA分子的破壞。這涉及到mRNA 3 '端處理和無意義介導的衰變等過程。反過來，這可以保護細胞免受錯誤折疊蛋白質的產生。

然而，我們在這裏關注的是如何在實驗室中進行良好的RNA質量控製，而不是細胞!在實驗室裏，你要檢查RNA的三個關鍵因素:數量、純度和完整性。下麵我們將逐一介紹。

1.測定RNA數量

測定RNA數量的傳統和最便宜的方法是用分光光度計測量樣品的紫外吸收。

A260量化:RNA的最大吸收波長為260nm。因此，RNA濃度由260nm處的吸光度讀數決定，該吸光度讀數由下麵的轉換所給出比爾蘭伯特定律: A260為1.0相當於40µg/mL的RNA。

2.測量RNA樣本的純度

為了測量樣本中RNA的純度，你需要評估RNA製劑中可能攜帶的其他東西。檢查樣本在不同波長下對應於其他生物分子(如蛋白質)的吸光度是很重要的。

測量A280蛋白汙染

除了A260，還應該在280nm處進行測量。A260/A280比值是樣品中蛋白質汙染水平的指示。純RNA的A260/A280比值為2.1。然而，對於許多協議來說，1.8-2.0之間的值是可以接受的。

A230其他汙染物

RNA製劑也可能含有汙染物，如胍鹽和苯酚(通常用於RNA分離方案)。A230的峰值表明這兩種汙染中的任何一種。理想的A260/A230比例大於1.5。

關於NanoDrop的說明™

使用傳統分光光度計進行這些測量的一個顯著缺點是它們需要大的樣本量。通常，分光光度計需要至少200 μ L的樣品體積，這取決於所使用的比色皿。

然而,NanoDrop™是優秀的分光光度計嗎用於測量RNA水平，隻需要1-2µL的樣品。此外，NanoDrop還包含用於RNA測量的預設程序，可以自動讀取230、260和280的OD值，並計算RNA濃度和A260/A280和A260/A230的比值。

現在許多部門和個人實驗室都有NanoDrop或類似的儀器，所以和你對麵的實驗室夥伴聊天，看看你是否可以使用他們的儀器!

測量RNA純度時要注意的三個字

1. 紫外線吸光度測量值可以根據pH值RNA溶液。當RNA溶於TE緩衝液時，得到了最好的結果。
2. 總是用稀釋RNA的相同溶液空白分光光度計。
3. 記住，RNA濃度低於20µg/mL可能無法給出可靠的讀數。

3.測量RNA樣本的完整性

所以如果你已經測量了RNA樣本的數量和純度並且得到了不錯的數字，你就可以開始了，對吧?不幸的是，事實可能並非如此。你的RNA可能被降解了!

RNA降解可以在實驗室中發生，原因有很多．降解RNA在下遊應用中表現不佳。因此，檢查RNA製備的完整性是很重要的。

測量RNA完整性的廉價而令人愉快的方法:瓊脂糖凝膠

檢查RNA完整性最便宜的方法是將RNA放入1%標準瓊脂糖凝膠中並檢查核糖體RNA (rRNA)帶(甲醛凝膠不需要這種快速評估)。要做到這一點，你需要:

1. 製作1%的瓊脂糖凝膠加上你選擇的核酸染色劑，讓它凝固。
2. 將少量RNA製劑與負載染料混合。
3. 在孔中加入RNA製劑和染料。
4. 加入你的緩衝液，像往常一樣使用凝膠。
5. 想象凝膠。

圖1顯示了在瓊脂糖凝膠上運行RNA樣本可能得到的一係列結果。上核糖體條帶(真核細胞為28S，細菌細胞為23S)的強度應該是下核糖體條帶(真核細胞為18S，細菌細胞為16S)的兩倍左右，並且應該是脆緊的，如凝膠Lane 1圖1所示。

然而，如果rRNA條帶強度相等，則表明發生了一些降解。mRNA運行在兩個核糖體帶之間，可能被視為塗片，如圖1示例凝膠的Lane 2所示。別慌，沒事的!

如果你看到一個與基因組DNA (gDNA)相對應的顯著的大尺寸條帶，由於其尺寸大而在凝膠上運行得更高，這強烈表明RNA被DNA汙染了，如圖1中的Lane 3所示。此外，在rRNA帶下麵塗抹表明你有低質量的RNA，如圖1的Lane 4所示。

然而，就像使用分光光度計來評估RNA數量一樣，使用瓊脂糖凝膠來評估RNA完整性的一個潛在問題是良好可視化通常所需的RNA數量。因此，您可能需要考慮不同的選擇。

測量RNA完整性的一個更昂貴的選擇:生物分析儀

檢查RNA完整性的第二種方法是使用生物分析儀，如安捷倫生物分析儀。生物分析儀使用少量RNA (1-2 μ L)和微流體來確定RNA樣本的數量和質量。分析儀測量rRNA條帶的大小，並確定RNA完整性數(RIN)，以標準化RNA樣品。[2]生物分析儀價格昂貴，但通常可以在核心設施中找到並收費使用。

如果你的RNA被降解了怎麼辦?

如果你發現你的RNA被降解了，在進行實驗之前準備新的RNA絕對是值得投資的，確保你采取措施，偏執或其他，以防止RNAse汙染!

RNA質量控製綜述

在後續實驗中使用RNA之前，檢查它的質量是很重要的，因為濃度可能太低，可能被蛋白質或提取過程中的試劑(如苯酚)汙染，或者它可能已經被降解。

最初發表於2014年3月。2022年9月審查和更新。

參考文獻

1. 米納克什K和帕克R (2007)真核生物RNA質量控製,細胞,131， 4,660 -668。
2. 施羅德，A，穆勒，O，斯托克，S。et al。(2006)RIN:為RNA測量分配完整性值的RNA完整性編號。BMC分子生物學73。