總RNA提取:獲得高純度RNA的簡便方法

DNA可以存活數千年，而RNA是短命的，這使得總RNA的提取很棘手，因為RNA容易被一種叫做RNA酶的酶降解，這種酶無處不在。

因此，從細胞和組織中分離總RNA需要一種方法，能夠有效地從樣本中分離RNA，同時最小化RNA降解。

什麼是總RNA?

總RNA，如你所料，是細胞內所有的RNA分子。這包括:

信使核糖核酸(mRNA):長蛋白編碼信使RNA轉錄本，在特定條件下作為細胞基因表達的瞬時讀出

微rna (MicroRNA的):無數其他較小的非編碼RNA分子，其中許多參與調節和沉默基因表達。

核糖體RNA (rRNA):核糖體的關鍵成分，對蛋白質合成至關重要。

轉移核糖核酸:蛋白質合成的另一個關鍵成分。這些RNA分子將氨基酸運輸到核糖體和mRNA的堿基對上，以確保正確的氨基酸被添加到正在合成的蛋白質中。

核糖核酸酶是什麼?

核糖核酸酶是一種能降解RNA的酶。這些酶在分離或處理RNA時很成問題，因為rna無處不在(無處不在)，很難消除，而且具有很強的破壞性．因此，你需要確保你是工作RNA-free提取總RNA時。

使用TRIzol®分離總RNA，減去RNA

幸運的是，有一些方法可以使RNA失活，防止你珍貴的RNA樣本被破壞。一種提取RNA同時抑製RNA酶的方法是胍鹽thiocyanate-phenol-chloroform提取方法首次應用於RNA提取Piotr Chomczynski和Nicoletta Sacchi。

TRIzol®是苯酚和異硫氰酸胍的單相混合物，通常用於RNA提取，是一種強大的蛋白質變性劑，可以分解蛋白質細胞成分，使所有酶(包括RNA酶)失活。

TRIzol提取通常使用酸性苯酚-氯仿將總RNA限製在一個透明的水相中，而蛋白質和細胞碎片最終在粉紅色的有機層中結束。RNA可以通過與異丙醇沉澱，洗滌，然後再溶於水來回收。TRIzol是一個品牌名稱，許多其他供應商提供他們自己的版本，包括:

• RNAzol®
• QIAzol
• TriPure™

這也是可能的自己製作苯酚和異硫氰酸胍的混合物．

使用TRIzol從細胞和組織中提取總RNA的協議

1.細胞溶菌作用

如果你從組織中分離RNA，你需要首先用1毫升TRIzol試劑均一每50到100毫克的組織使用均一器。樣品體積不應超過TRIzol體積的10%。

如果你從培養中培養的粘附細胞中分離RNA，用冰冷的PBS衝洗細胞，然後直接在培養皿或燒瓶中溶解細胞，每10厘米²的麵積加入1毫升TRIzol試劑，然後用細胞刮刀或移液管尖刮。

將細胞裂解液通過移液管多次，並徹底渦旋。如果培養液由懸浮細胞組成，將細胞旋轉下來以去除舊培養基，用1毫升TRIZOL在PBS溶解細胞中洗滌，通過上下移液多次，可清洗多達1000萬個細胞。

2.培養和苯酚-氯仿分離

將均質樣品在室溫下孵育5分鍾，使核蛋白複合體分離。

每1卷TRIzol試劑加入0.2卷氯仿。蓋好管子，用力使樣品旋轉15秒。

室溫下孵育樣品5分鍾。

4℃，不超過12000 x g，離心15分鍾。混合物將分離成三種相(圖1)。

1. 較低的有機相。
2. 間期。
3. 上麵的水相含有RNA。

3.RNA降水

小心地將上麵的水相轉移到一個新鮮的管中，不要幹擾間相。水相的體積通常約為步驟1中TRIzol體積的60%。

每1ml TRIZOL使用0.5 ml異丙醇從水相中沉澱RNA。

室溫孵育10分鍾，4℃不大於12000 x g離心10分鍾。RNA沉澱會在試管的一側或底部形成顆粒，肉眼很難看到。

4.RNA洗滌和再懸浮

除去上清液，用75%乙醇清洗RNA顆粒一次。

用渦流混合樣品，在4°C下以不超過8000 x g的溫度離心5分鍾。重複上述清洗步驟，去除所有剩餘的乙醇。

空氣幹燥或真空幹燥RNA顆粒5-10分鍾，但不要加熱或真空離心機。同時，避免RNA過度幹燥，否則將很難重新溶解顆粒。

將RNA溶解在depc處理過的水中，將溶液通過移液管尖端幾次。

5.測定RNA濃度和純度

一旦你的樣品被重新溶解，通過在260nm和280nm處測量OD來確定樣品的濃度和純度．A260/A280的比值應該在1.6以上。

TRIzol對總RNA提取的好處

TRIzol對總RNA提取有很多好處，包括:

• 核糖核酸酶的變性。
• 總RNA的提取，包括小分子量RNA如miRNA。
• 高質量的RNA。
• 使用起來相對簡單。
• 允許從樣本中同時提取DNA，蛋白質和RNA。

使用TRIzol的缺點

TRIzol用於總RNA提取有一定的局限性。

• 與其他傳統的RNA提取方法相比，這種試劑可能昂貴。
• 使用危險和有害的化學品。
• 在去除水層時，提取的RNA會被苯酚和其他汙染物汙染。
• 執行起來可能很耗時，而且學習曲線很陡。

TRIzol提取RNA的替代方法

TRIzol總RNA提取的危險性質和陡峭的學習曲線導致了更安全、更簡單的RNA提取替代品的市場，但仍能提供高質量的RNA。

核糖核酸提取試劑盒

市麵上有許多不使用TRIzol或其他危險化學物質的商用套件。它們使用自旋柱或磁珠來捕獲RNA，然後進行洗脫。然而，它們可能不適合所有的應用程序，所以在購買之前檢查用戶手冊，檢查工具包:

• 適用於您的示例類型。
• 分離你感興趣的RNA。

如果你要從專業組織樣本(如血液、纖維組織、植物組織)中提取DNA，檢查一下是否有可用的試劑盒。製造商已經創建並優化了從一係列組織和源材料中提取RNA的試劑盒。

如果您想要分析miRNA或其他小分子量RNA物種，請注意。許多RNA分離試劑盒，特別是使用自旋柱的試劑盒，可能無法成功分離這些小分子。然而，專門為miRNA和其他小RNA分子設計的定製套件是可用的。

提供RNA提取試劑盒的公司包括:

• 試劑盒
• ThermoFisher科學
• SigmaAldrich
• Zymo研究
• Promega
• 安捷倫科技
• 羅氏公司

雖然RNA提取試劑盒提供了一個方便的選擇，但它們可能很昂貴，如果你從各種組織中分離RNA，你可能需要多個試劑盒。

有一些試劑盒可以與TRIzol提取結合使用，在沉澱步驟之後捕獲RNA，使後續的洗滌和洗脫更容易和更快。如果您已經在TRIzol中存儲了樣本，那麼這可能是一種選擇。

老式的總RNA提取方法

如果你不想使用商業試劑盒，但仍然想避免TRIzol(和替代品)的成本，考慮回到老派的總RNA提取方法。

下麵我們分享一種從酵母(也可用於其他來源)中提取總RNA的無trizol方法維姬Doronina．注意，這種方法仍然使用危險的化學物質，因此在使用之前可以仔細考慮。

這種總RNA提取方法使用了苯酚和一些鹽的混合物。所有需要的是一些Tris, SDS，和苯酚氯仿混合物。Vicki從未在非酵母細胞上使用過這種方法，但她幾乎可以肯定，在RNA緩衝液中經過均質化步驟後，這種方法可以應用於任何類型的細胞。將緩衝液的pH值從中性改為酸性(pH值為4.5)也可以分離出氨基酰化的trna。

酚-氯仿RNA提取協議

1.培養25-100毫升細胞至OD₆₀₀= 0.25 - -0.5 (你甚至不需要分光光度計）.

2.旋轉細胞，用1ml dH衝洗₂O，並轉移到螺旋蓋管。你可以在這個階段快速冷凍顆粒。

3.在1體積冷RNA緩衝液中加入最終濃度0.5%的SDS(1/40體積20% SDS)。

4.用200 μ l的冷SDS/RNA緩衝液重懸冷凍小球。

5.加入1卷苯酚氯仿;用珠子填充達到上述溶液。

6.打破(通常30秒/ 1分鍾在冰上/30秒在最大的核糖核酸設定)，但你的常規打破程序可以同樣有效。

7.用RNA緩衝液填充試管(不添加SDS)，旋轉，保持低溫旋轉5分鍾。

8.你會在管的底部看到苯酚-氯仿的部分，白色的碎片層和頂部緩衝層。取頂層，轉移到一個新鮮的RNase-free Eppendorf。

9.用苯酚-氯仿提取水餾分兩次，振蕩5分鍾。加入0.9-1體積的異丙醇，混合，旋轉15-20分鍾。因為緩衝液含有大量鹽，不需要額外的醋酸鈉

(如不小心加入1/10 3M醋酸鈉，將幹燥顆粒溶解於600 μ l RNA緩衝液中，搖勻孵育5min，加入600 μ l異丙醇，旋轉10 - 5min，轉步驟9)。

10.用70%洗淨顆粒，風幹，30-50 μ l dH重懸₂O或TE，測量OD260/280的比值。

RNA緩衝液(50ml)

• 100 mM EDTA pH 8.0 (10 mL 0.5M原液)
• 100mm NaCl (1ml 5M原液)
• 50 mM Tris-HCl pH 8.0 (2.5 mL 1M原液)
• 36.5毫升dH₂O

總RNA提取綜述

從一係列樣本中提取總RNA的方法有很多，從“金標準”TRIzol到市售的自旋試劑盒和老派的苯酚-氯仿提取。每一種RNA分離方法從成本、危險化學品的使用和適用性等方麵都有其優缺點，每種方法在選擇之前都應仔細考慮。

你使用哪種總RNA提取方法?請在下方留言。

最初發布於2013年3月13日。回顧和2022年2月更新。