DNA和RNA的乙醇沉澱:如何工作

2021年3月30日出版

乙醇沉澱是一種在水溶液中濃縮和脫鹽核酸(DNA或RNA)製劑的常用技術。

基本程序是鹽和乙醇加入到水溶液中，這迫使核酸沉澱出溶液。沉澱之後，核酸可以通過離心從溶液的其餘部分分離出來。然後在70%的乙醇中清洗球團。在進一步的離心步驟後，除去乙醇，讓核酸球團幹燥，然後在清潔的水緩衝液中重懸。

那麼這是如何工作的呢?

這都是關於溶解度…

首先，我們需要知道為什麼核酸可以溶於水。水是極性分子——由於未共用電子對，它在氧原子附近帶部分負電荷，在氫原子附近帶部分正電荷。由於這些電荷，像DNA或RNA這樣的極性分子可以與水分子發生靜電作用，使它們很容易溶解在水中。因此，極性分子可以被描述為親水分子，而不容易與水分子相互作用的非極性分子則是疏水的。核酸親水是由於帶負電荷的磷酸鹽(PO_3.^{- - - - - -})沿著糖-磷酸鹽骨架的基團。

鹽的作用…

好了，回到協議上來。在該方案中，鹽的作用是中和糖-磷酸鹽骨架上的電荷。一種常用的鹽是醋酸鈉。在溶液中，醋酸鈉分解成鈉⁺和[CH_3.首席運營官)^{- - - - - -}．帶正電的鈉離子中和PO上的負電荷_3.^{- - - - - -}核酸上的基團，使分子親水性大大降低，因此在水中的可溶性大大降低。

乙醇的作用…

Na和Na之間的靜電吸引⁺溶液中的離子和PO_3.^{- - - - - -}離子由庫侖定律，受溶液介電常數的影響。水的介電常數很高，這使得鈉很難存在⁺和阿寶_3.^{- - - - - -}走到一起。另一方麵，乙醇的介電常數要低得多，這使鈉更容易分解⁺與訂單交互_3.^{- - - - - -}．這屏蔽了它的電荷，使核酸不那麼親水，從而導致它從溶液中脫落。

溫度的作用…

在低溫(例如-20°或-80°C)下孵卵核酸/鹽/乙醇混合物通常被引用為協議中的必要步驟。然而，根據Maniatiset al。分子克隆，實驗室手冊^nd2版……^nd版? ?-我需要一個更新的版本!)，這是不需要的，因為核酸濃度低至20 ng/mL會在0-4°C下沉澱，所以在冰上孵卵15-30分鍾就足夠了。

70%乙醇洗滌步驟…

這一步是將殘留的鹽從DNA顆粒中洗掉。

關於乙醇沉澱的幾點建議…

鹽的選擇
- 使用醋酸鈉(0.3 M final conc, pH 5.2)進行常規DNA沉澱。
- 使用氯化鈉(0.2 M final conc)用於含有SDS的DNA樣品，因為NaCl使SDS在70%乙醇中可溶，因此它不會與DNA沉澱。
- 使用無水氯化鋰(0.8 M最終conc)為RNA。由於RNA的沉澱需要2.5-3體積的乙醇，而且LiCl比醋酸鈉更容易溶於乙醇，所以不會沉澱。但是要注意-氯離子會抑製蛋白質合成和DNA聚合酶，所以LiCl對RNA的準備沒有好處在體外翻譯或反轉錄．在這種情況下，使用醋酸鈉。
- 使用醋酸銨(2 M final conc)用於去除dNTPs，但不要使用它來製備用於T4多核苷酸激酶反應的DNA，因為銨離子抑製酶。

提高低濃度或小核酸片段(小於100個核苷酸)的沉澱收率
- 添加MgCl₂最終濃度為0.01 M。
- 將離心前在冰上孵育的時間增加到1小時。

這個解釋應該能讓你快速了解乙醇沉澱是如何工作的。如果你想了解更多乙醇沉澱和其他DNA清理方法的來由，你可能想看看這些……