將質粒DNA,開放和執行miniprep破解你的細胞,努力避免汙染基因組DNA。基因組DNA,你破解你的細胞在不同的方式,試圖孤立盡可能多的內容。

協議的區別是什麼?

在本文中,我們將著眼於質粒基因組DNA提取,和這些技術的方式是不同的。

基因組DNA提取:

1。消散:就打碎

(gDNA)基因組DNA提取簡單的過程,因為強烈的溶解是唯一必要釋放gDNA進入解決方案。酵母、植物和細菌,裂解涉及酶破壞強,剛性細胞壁機械破壞前等離子體膜。

細胞壁通常消化與溶菌酶,水解細胞壁肽聚糖,絲氨酸蛋白酶和蛋白酶k對某些革蘭氏陽性的物種,溶葡球菌酶酶消化將進一步援助。您可能需要使用不同的酶與不同的細胞壁成分更多的外來物種。

機械細胞壁破壞代表了一個更普遍的溶解方法gDNA提取。珠跳動是受歡迎的,你可以很容易地在一個漩渦使用0.1毫米玻璃珠或0.15毫米細石榴石珠子。特殊渦適配器幫助執行多個抽取,同時以同樣的效率。珠擊敗比酶溶解快,一般更徹底。

為艱難的絲狀真菌(如。曲黴屬真菌和鐮刀菌素spp),細胞材料通常是snap-frozen液氮和研磨杵和臼隨後快速渦流與合適的裂解緩衝溶液。

2。…和淨化

細胞溶菌作用後(這讓gDNA進入解決方案),剩下要做的唯一的事就是淨化樣品。這可以通過使用phenol-chloroform或自旋過濾膜技術與胍鹽促進綁定添加到二氧化矽。

3所示。幾句忠告

染色體將打破在淨化,因為它們太大保持完好無損;對於大多數應用程序來說這不是一個問題。事實上,PCR和qPCR破損可能是有利的,因為它艾滋病DNA融化,導致更有效的放大反應。然而,使用大的DNA片段(例如應用程序。長閱讀測序和長期測序),這可能是一個嚴重的問題。如果你需要為這些應用程序隔離超長DNA片段,你應該考慮另一個設置。

的大腸杆菌染色體是超過4.5 MB,總計大約.005皮克/細胞。一夜之間一個典型的文化從一個殖民地開始將包含大約1 - 2×10⁹細胞/毫升。從理論上講,這意味著1毫升的文化應該收益率大約5µg gDNA每109個細菌細胞。考慮到這在計算你需要多少DNA您選擇的應用程序。

質粒提取

質粒提取有點棘手,因為質粒DNA必須保持gDNA分開。這種分離是基於大小,和良好的分離依賴於使用正確的溶解方法。

1。堿性溶菌作用

質粒提取,細胞溶解更微妙的不僅僅是咀嚼的細胞壁酶或用玻璃珠抨擊它。Birnboim,輕而易舉地發明了(幾乎)的通用方法質粒提取1979年通過堿溶菌作用。

裂解緩衝含有氫氧化鈉和SDS,完全變性質粒和gDNA(即DNA分離成單個鏈)。關鍵是執行這一步很快,因為過度變性可能會導致不可逆的變性質粒。

接下來,樣品中和在乙酸鉀溶液複性質粒。這是質粒的分離和gDNA的關鍵。因為質粒很小,他們可以很容易地再退火形成dsDNA。然而基因組DNA,再退火完全太長,相反,它往往糾結這互補鏈保持分離。

在離心,gDNA(綁定到蛋白質)形成一個球而質粒DNA仍可溶。關鍵在這一步不是漩渦或混合樣本大力因為gDNA破壞容易,和破碎的gDNA可能足夠小質粒再退火和進入解決方案。

2。淨化

質粒DNA在上層清液可以乙醇沉澱或清理使用phenol-chloroform或自旋過濾器。如果您正在使用自旋過濾技術,中和緩衝將包含胍鹽的溶解產物可以直接綁定矽進一步洗滌和洗脫。由此產生的DNA是純足以讓大多數下遊分子生物學的應用程序。如果你需要的質粒轉染、陰離子交換淨化是一個更好的選擇去除汙染內毒素。內毒素去除還可以使用更快的矽基淨化裝置。

這個方法是兼容與哺乳動物和其他真核質粒以及其他小extra-chromosomal DNA的物種。然而,請記住這一點質粒拷貝數通常是在哺乳動物細胞和植物胞質的細胞器低很多。

3所示。…和一些建議

質粒DNA通常是3 - 5 kb,取決於插入大小。具體的起源的複製現在會影響每個細胞的質粒拷貝數。典型的高拷貝質粒如加州或pBluescript應該產生4 - 5µg DNA的每毫升的文化。

隔離高收益率的質粒DNA,用文化後期日誌階段或早期的固定相。準備使用新鮮的單一文化殖民地和新鮮選擇抗生素為質粒濃度在正確的維護。重要的是不要長得超過細菌培養,因為這可能導致gDNA汙染質粒提取。

如今,有一個工具包,和互聯網包含大量信息提取的DNA質粒,基因組和介於兩者之間的!

進一步閱讀:

從全血DNA產量最大化。//www.mobtapp.com/30243/maximizing-yield-whole-blood-dna-extraction/

最早出版於2014年,2019年再版。