PIER, HIER和Mannich:免疫組織化學中的抗原檢索
當你用多聚甲醛(PFA)固定你的組織樣本時，樣本中的蛋白質變成共價交聯。這有助於保存組織樣本的“結構”。然而，當你進行免疫組化(IHC)時，這種交聯可能成為一個問題。
交聯可以“掩蓋”或隱藏你感興趣的抗原，使它們對你的免疫組化檢測抗體“不可見”。這就是需要知道“抗原提取”或“揭開”的地方。
我在避孕疫苗領域工作了20多年，研究精子/卵子識別。我的大部分工作涉及PFA固定組織的免疫組化。在這段時間裏，我感興趣的一些蛋白質被證明很難檢測和成像。就在那時，我們的組織學實驗室向我介紹了一種似乎很奇怪的技術:在進行免疫組化之前，將載玻片在微波爐中加熱。
但奇怪的是，烹飪我的幻燈片竟然成功了!它改變了我的免疫組化結果。很快，“在微波爐中烹飪我的幻燈片”成為我的免疫組化方案的常規部分。
但是加熱並不是揭開抗原麵具的唯一方法。蛋白質水解酶也能發揮很大的作用。那麼，加熱和蛋白水解酶為什麼以及如何在組織樣本中檢索抗原呢?
要回答這個問題，首先我們需要回顧PFA固定過程中組織發生了什麼。簡而言之，在固定過程中，PFA與蛋白質的胺基反應形成中間離子。然後，這種中間體與酪氨酸殘基中的酚基反應，形成共價鍵，並將蛋白質與自身和其他蛋白質交聯，固定組織樣本的“結構”。這種固定可以掩蓋、隱藏或以其他方式“掩蓋”你感興趣的蛋白質，抑製其免疫反應性。
如何反應:曼尼奇反應
起初，人們認為熱量或酶隻是簡單地破壞了PFA固定過程中蛋白質之間形成的交聯。然而，它似乎稍微複雜一些。在一個2007年發表的論文1時，有人建議曼尼希反應’。本文提出抗原提取實際上是去除了幹擾抗原識別的交聯蛋白。
然而，圍繞這項技術仍有一些猜測。
你的選擇:兩個檢索選項……或者根本沒有
您並不總是需要向您的IHC協議添加檢索步驟。如果你使用的是一種能識別多種抗原的抗體，例如，如果你使用的是一種多克隆抗體，那麼你應該在沒有揭開掩蔽的情況下得到很好的結果(盡管使用多克隆抗體你將麵臨更多的背景染色)。
但如果你需要進行抗原提取，你有兩個選擇:加熱或酶。如果你的組織特別脆弱，我建議用熱回收法。一些用於揭罩的酶會對組織產生破壞性影響，不僅會改變組織的“結構”，甚至可能會破壞你試圖檢測和成像的抗原(不好)。
選擇1:蛋白水解誘導表位提取(PIER)
在“蛋白水解誘導表位恢複”(或“PIER”)中使用的三種最常見的酶是胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶k。胰蛋白酶對大多數組織類型和大多數抗體都有效，但請先檢查抗體數據表。
執行PIER有兩種方法：
- 第一個就是直接把酶加到幻燈片上，
- 第二個就是把你的載玻片放在架子上浸泡在含有酶的染色皿中。
第一種方法使用較少的酶，但是在幻燈片中添加酶需要時間，所以如果您正在處理大量幻燈片，請考慮到這一點，因為時間在PIER中至關重要。
PIER中使用的酶通常需要在37℃下孵育10-20分鍾0C.如果您選擇浸泡法(方法2)，保持這個溫度很容易，隻需將染色盤放在細胞培養室或水浴中即可。然而，如果你選擇第一種直接添加酶的方法，20分鍾的孵育時間足夠長，蒸發就會成為問題。所以如果這是你的選擇，一定要在潮濕的房間裏做。
PIER方案樣本(含胰蛋白酶)
所需材料:
- 0.5%胰蛋白酶原液．將50毫克胰蛋白酶溶解於10毫升dH中2阿水。在零下20度儲存0C。
- 1%氯化鈣原液。使100毫克氯化鈣溶於10毫升dH2O. 4號店0C。
- 0.05%氯化鈣溶液“工作溶液”．將1毫升0.5%胰蛋白酶原液和1毫升1%氯化鈣原液加入8毫升dH中2O，用NaOH調整pH值至7.8。4號店0C最多一個月。你要把酶放入這個溶液中。
方法:
- 脫蠟並給玻片補水。看到這個關於脫蠟和再水化的更多細節．
- 加入酶。如果直接移液到幻燈片上，預熱你的工作解決方案，然後將其添加到幻燈片的各個部分。然後在37℃的潮濕室中培養0C細胞培養室(你的實驗確定)所需的時間。如果沉浸在幻燈片中預熱緩衝和載玻片/支架。要加熱玻片/玻片架，在染色盤中倒入超純水，放在水浴池中，加入玻片架和玻片。
- 反應結束。在所需的時間後，從酶上取出載玻片，放在冷水龍頭下三分鍾。檢索完成。繼續你其餘的免疫組化方法。
選擇2:熱誘導表位提取(HIER)
雖然“熱誘導表位提取”或HIER的早期方法大多使用微波爐，但現在壓力鍋被廣泛使用。現在甚至可以買到主要為HIER設計的科學微波爐。這是理想的，因為一些烤箱，特別是老式的家用烤箱，可能有冷點，是為加熱食物而設計的，而不是紙巾和玻璃!
在HIER過程中，熱量導致固定過程中形成的蛋白質交聯斷裂，蛋白質原有結構展開。在加熱過程中使用的緩衝液也很重要，因為它進一步幫助蛋白質展開。
與PIER一樣，HIER方法對溫度和時間敏感(以及pH敏感)，因此在使用樣品之前總是使用控製載玻片來優化方法。
HIER方案樣本(檸檬酸鈉/高壓鍋)
這是最常見的檢索方法之一，適用於廣泛的免疫組化方法。
所需材料:
- 檸檬酸鈉緩衝液。將2.94克檸檬酸三鈉(二水)與1升dH混合2O.用1N HCl調節pH至6.0。加入500毫升Tween 20拌勻。在室溫下保存3個月或在4°C下保存6個月。
方法:
- 脫蠟並補水幻燈片。
- 加入檸檬酸鈉緩衝液到你的高壓鍋(足夠蓋上幻燈片架)。把高壓鍋放在電爐上。在通風櫃裏做這個!
- 烹飪你的幻燈片。把熱板調到最大溫度。當緩衝液沸騰時，小心地將架子或滑塊放入高壓鍋中。給高壓鍋蓋上蓋子。當炊具達到壓力時，設置計時器三分鍾。
- 打開減壓閥．三分鍾後，關掉電爐。將高壓鍋放在通風櫃的金屬表麵上。打開減壓閥。小心非常熱的蒸汽!讓高壓鍋冷卻20分鍾。
- 打開蓋子．將高壓鍋轉移到水槽中，小心地打開蓋子。將冷水龍頭放入炊具/載玻片5分鍾。檢索完成。繼續你其餘的免疫組化方法。
以上就是我對PIER和HIER的簡要概述。兩者或其中一種都能顯著提高你的免疫組化結果。請記住，無論何時處理免疫組化步驟，您都需要對條件、準確的時間和濃度等進行實驗，以找到最佳結果。和往常一樣，在使用任何珍貴的樣本之前，一定要在對照組織上嚐試任何新的檢索方法!
參考文獻
1.梁泰，梁雅士(2007)抗原提取是如何工作的?Adv Anat Pathol。14(2): 129 - 31所示。