氣相色譜豐富區域的放大問題?5個簡單的解決辦法

PCR失敗後的另一個空白凝膠?你在放大富含gc的DNA區域方麵有問題嗎?

不，這不是你的問題，如果你在擴增富gc序列或理解富gc序列為什麼會導致這種問題上遇到困難，你當然不是一個人!

用PCR擴增富gc區域的問題幾十年來一直是科學家們的一個煩惱!

如果你在獲得富含gc的區域的良好擴增方麵有問題，有幾種選擇，單獨或聯合使用可能會幫助你解決這個問題。

但首先，讓我們看看為什麼富含gc的序列更難放大。

是什麼導致了富gc區域放大的問題?

問題1:熱穩定性和結構穩定性

首先，我們所說的富gc區是什麼意思?當我們說“富GC”時，我們的意思是大約60%的堿基是胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)。

富含GC的DNA序列比低GC含量的序列更穩定。對於PCR來說，這意味著GC含量越高，DNA的熔點越高。

與普遍的看法相反，富含gc的DNA序列的穩定性增加主要不是因為氫鍵。穩定主要是由於疊加相互作用，稱為基疊加。這種堆積現象背後有一些美麗的生物化學和生物物理學原理。(1）

這就是為什麼棲熱菌屬酸奶它是一種需要忍受非常高的環境溫度的嗜極生物，擁有富含gc的基因組。這也是為什麼我們基因組中(當然，假設你是人類!)需要經常轉錄的區域，比如高表達基因的啟動子區域，是at豐富的，就像TATA盒子。

問題2:次生結構的形成

這一點與第一點密切相關。當富含gc的區域形成二級結構，特別是發夾環時，它們非常穩定，所以它們會留在周圍並積累。此外，在通常的PCR變性溫度下，這些二級結構不能很好地熔化。

此外，用於擴增gc豐富區域的引物往往會形成自二聚體和交叉二聚體以及莖環(或發夾)結構，這些結構會阻礙DNA聚合酶沿著模板分子的進程，導致PCR產物被截斷。引物3 '端富含gc的序列也可能導致引物錯誤。

一場災難!

噗!*你對自己做PCR泄氣能力的自信之聲*

但是等等!我們有幾個解決方案為您，如果您在您的PCR中有問題的gc富區放大!

5個簡單的解決方法，如果你有問題放大富含gc的區域

解決方案1:提高你的融化溫度

這是一個非常明智和簡單的解決方案(至少在理論上是這樣)。熔化溫度越高，富含gc的區域形成的次級結構就越容易分離。

然而，要小心，因為這可能導致較低的產品產量!這是因為你選擇的酶，也就是進行擴增的酶，在超過92.5°C的溫度下會開始更快地變性。

因此，建議在頭幾個循環中隻使用較高的熔化溫度，並絕對避免超過95°C。這可能需要一些嚐試，但如果你在放大富含gc的區域方麵有問題，這個解決方案通常是一個很好的、簡單的起點。

解決方案2:調整鎂的濃度

一般來說，非特異性擴增會加劇，甚至會因在PCR反應中使用過量的鎂而引起。因此，使用梯度PCR或滴定PCR檢測最佳濃度是一個好主意。

簡而言之，絕對左邊的井或管中所含的鎂應該少於你認為有效的，絕對右邊的井或管中所含的鎂應該超標。這樣可以在中間形成一個漸變，這樣你就可以確定你可以使用的最小的量來達到你的產品。

解決方案3:在PCR反應中使用添加劑

另一種研究人員可能改善富氣相色譜區域放大問題的方法是通過在他們的PCR反應中使用添加劑。這些可以包括添加劑，如DMSO，甘油和牛血清白蛋白。

然而，對於這些添加劑並沒有嚴格的規定;它們的效果可能高度可變，這取決於特定的目標，循環條件，以及用於擴增的特定PCR酶和緩衝液。

解決方案4:更換聚合酶或緩衝液

所以這個解決方案可能不是解決你的問題最便宜的方法，但有時偉大的科學需要購買一些花哨的新產品!

一些公司已經開始開發專門用於擴增富gc區域的緩衝液和聚合酶。其中一個例子就是來自NEB的OneTaq GC緩衝區．這個緩衝區可以通過高GC增強器進一步補充。

其他公司已經優化了新的聚合酶，以幫助放大富含gc的區域。ThermoFisher開發了AccuPrime™GC-Rich DNA聚合酶，它起源於古細菌延fumarius．

這種聚合酶的連續性比TaqDNA聚合酶。在95°C溫度下4小時後，它仍保持活性，使您可以將此與我們的第一個提示相結合，提高您的融化溫度!

解決方案5:完全改變你的PCR方法

為了提高PCR的成功率，研究人員還開發了全新的方法，在富含gc的模板上進行PCR。一個這樣的例子被稱為放緩PCR．慢速PCR需要在PCR混合物中加入dGTP類似物7-deaza-2 ' -脫氧鳥苷。

慢速PCR還使用了一種標準的循環協議，可以在不同的溫度下使用。一般來說，與更標準的PCR程序相比，坡道率降低，PCR運行額外的周期。[２]

總結富氣相色譜區放大問題

現在你明白了為什麼放大PCR反應中富含gc的區域會讓你頭疼，但最重要的是，你有很多解決問題的選擇!

請在下麵的評論中告訴我們你的方法。

最初發表於2015年5月26日。2022年6月審核並更新。

參考文獻

1. 庫爾等。(2001)DNA複製中的氫鍵、堿基堆積和空間效應．Annu Rev Biophys biool結構．30.:22頁。
2. 弗雷，巴赫曼，彼得斯。et al。(2008)gc豐富區域的PCR擴增:“慢速PCR”。Nat Protoc3.1312 - 1317。