無縫連接克隆提取(切片)探索和解釋

傳統上，如果你希望克隆一個DNA/RNA片段(或插入)到一個載體中，比如BAC，你需要:

1. 昂貴的外切酶，稱為限製性內切酶:類似於吃豆人的酶，可以在目標載體或要插入的片段(通常隻是“插入物”)中咀嚼特定序列。
2. 插入和目標向量之間的同源序列，稱為限製位點。
3. 連接酶:一種酶，它通過填充插入物與載體結合後留下的間隙，將序列粘合在一起。

這個過程看起來像這樣:用外切酶切割你的載體，暴露出與你的插入物末端互補的末端，然後用連接酶將你的插入物插入到載體上。這是一個昂貴且有問題的過程，隨著連接酶獨立的曙光出現，它的受歡迎程度已經降低和/或無限製性內切酶克隆等方法SLIC,CPEC,TOPO和Gibson(吉布森使用Taq連接酶)。

對於那些仍然堅持使用限製性內切酶和連接酶的人來說，這種不依賴連接酶的方法會導致小錯誤當你用PCR來放大你的產品時，我給你校對酶，比如Phusion這將使風險最小化。

介紹片

SLiCE是另一種無連接酶和限製性內切酶克隆方法，與上述方法非常相似。首先由張等人2012年SLiCE公司利用細菌細胞提取物將多個DNA片段組裝成重組DNA分子，並且全部都在同一個地方在體外複合反應。訣竅:短端同源15-52 bp，可以在沒有或與側翼異源序列結合的情況下使用。這允許從BACs和其他載體定向亞克隆DNA插入或片段。

自許多標準實驗室菌株你可以收獲你的切片提取物，這種方法比傳統克隆更劃算。一些菌株比其他菌株更有效，例如PPY，一種大腸杆菌DH10B表示?紅色重組係統。那麼為什麼要用這種方法呢?讓我們去高峰!

使用這種方法的原因

1. 高通量篩選的成本效益
2. 它是“無縫的”，這意味著它不需要你添加酶靶向和切割的位點(稱為連接位點)，所以你不會在你的產物周圍散布不必要的序列。
3. 它不需要使用昂貴的限製性內切酶或連接酶。
4. 你可以使用PCR擴增或酶切產生的片段。
5. 你可以將幾個步驟組合成一個切片，允許在一個克隆步驟中組裝多個DNA片段。這使得它成為一個很好的選擇多個DNA片段的組裝在基因合成實驗中。

聽起來不錯!

步驟是什麼?

這裏的主要玩家是你的質粒和切片提取物。

步驟1:設計和創建你的質粒。

步驟2:選擇您的大腸杆菌從穩定、合格的原液中培養和收獲細胞。在裂解液中裂解這些細胞，離心分離克隆插入DNA中的細胞碎片。保留上清液，丟棄顆粒。這些細胞提取物可以儲存在50%的甘油在-80^oC如果必要的話。

步驟3:通過PCR擴增或限製性內切酶切使目標質粒載體線性化，並使用專門設計的引物擴增您感興趣的克隆插入物。這些引物必須包含與載體或其他克隆插入物同源的5 '末端(為了創建一串附加片段，盡管這些片段的末端必須包含5 '同源末端)。

步驟4:一旦殘留的質粒模板DNA被移除，線性化的載體和PCR片段可以使用凝膠電泳測試以確認成功生成。

步驟5:釋放你的載體和片段從凝膠使用淨化提取。

步驟6:在含有氯化鎂，ATP, DTT和Tri-HCl的切片緩衝液中孵育你的載體和碎片，溫度為37^oC為1小時。

第七步:通過電穿孔或化學轉化將你的片段-載體雜交轉化成有能力的細胞。

第八步:通過在適當的抗生素或任何你設計的載體被檢測的情況下電鍍，分離所有成功利用片段-載體雜交的細胞。

有關詳細信息，請參見原始論文並了解一些限製以及如何繞過它們。

這是一個奇妙而簡單的方法，不需要太多的優化——唉，少抱怨，多克隆!