DNA和RNA的乙醇沉澱:如何工作

乙醇沉澱是一種在水溶液中濃縮和脫鹽核酸(DNA或RNA)製劑的常用技術。

基本步驟是鹽和乙醇被添加到水溶液中，這迫使核酸從溶液中析出。沉澱後，通過離心將核酸從其餘溶液中分離出來。然後在70%乙醇中清洗顆粒。在進一步離心步驟後，除去乙醇，讓核酸顆粒幹燥，然後在清潔的水緩衝液中重新懸浮。

那麼這是如何工作的呢?

關鍵在於溶解度……

首先，我們需要知道為什麼核酸能溶於水。水是極性分子——由於未共用電子對，氧原子附近帶部分負電荷，氫原子附近帶部分正電荷。由於這些電荷，像DNA或RNA這樣的極性分子可以與水分子發生靜電作用，使它們很容易溶解在水中。因此，極性分子可以被描述為親水分子，而非極性分子不容易與水分子相互作用，是疏水分子。核酸是親水的，因為帶負電荷的磷酸鹽(PO_3.^{- - - - - -})沿糖-磷酸骨架的基團。

鹽的作用…

好，回到協議。鹽在該方案中的作用是中和糖-磷酸鹽主幹上的電荷。一種常用的鹽是醋酸鈉。在溶液中，醋酸鈉分解成鈉⁺和[CH_3.首席運營官)^{- - - - - -}．帶正電荷的鈉離子中和了PO上的負電荷_3.^{- - - - - -}核酸上的基團使分子的親水性大大降低，因此也就大大降低了溶於水的能力。

乙醇的作用…

鈉離子之間的靜電引力⁺溶液中的離子和PO_3.^{- - - - - -}離子由庫侖定律，受溶液介電常數的影響。水有很高的介電常數，這使得鈉很難存在⁺和阿寶_3.^{- - - - - -}走到一起。另一方麵，乙醇的介電常數要低得多，這使得鈉更容易生成⁺與訂單交互_3.^{- - - - - -}．這屏蔽了它的電荷，使核酸不那麼親水，從而導致它從溶液中掉出來。

溫度的作用……

在低溫(例如-20°或-80°C)下培養核酸/鹽/乙醇混合物通常被引用為方案中的必要步驟。然而，根據Maniatiset al。分子克隆，實驗室手冊^nd2版……^nd版? ?-我需要一個更新的版本!)，這是不需要的，因為核酸濃度低至20 ng/mL會在0-4°C沉澱，所以在冰上孵卵15-30分鍾就足夠了。

70%乙醇的洗滌步驟…

這一步是將殘留的鹽從DNA顆粒中洗掉。

關於乙醇沉澱的幾點建議…

• 鹽的選擇
  • 使用醋酸鈉(0.3 M終conc, pH 5.2)用於常規DNA沉澱。
  • 使用氯化鈉(0.2 M最終conc)對於含有SDS的DNA樣品，因為NaCl使SDS可溶於70%乙醇，因此它不會與DNA沉澱。
  • 使用無水氯化鋰(0.8 M最終conc)的RNA。由於RNA沉澱需要2.5-3體積的乙醇，而LiCl比乙酸鈉更易溶於乙醇，因此不會沉澱。但要注意-氯離子會抑製蛋白質合成和DNA聚合酶，所以LiCl對RNA的準備沒有好處在體外翻譯或逆轉錄．在這種情況下，使用醋酸鈉。
  • 使用醋酸銨(2 M最終conc)用於去除dNTPs，但不要將其用於T4多核苷酸激酶反應的DNA製備，因為銨離子會抑製酶。

• 提高低濃度或小核酸片段(小於100個核苷酸)沉澱的產量
  • 添加MgCl₂最終濃度為0.01 M。
  • 將離心前在冰上孵育的時間增加到1小時。

這個解釋可以讓你快速了解乙醇沉澱是如何工作的。如果你想了解更多關於乙醇沉澱和其他DNA清理方法的來由，你可能想看看這些…

更多關於乙醇沉澱的文章

• 乙醇沉澱- DNA vs異丙醇
• 如何在DNA/RNA乙醇沉澱後得到完美的顆粒

最初發表於2007年12月4日。2021年3月審閱並再版。