克隆方法:5種不同的組裝方法

過去幾十年來分子生物學家已經開發出程序來簡化和規範克隆過程,允許大量人工DNA陣列結構更容易組裝。

你熟悉所有克隆選項呢?

讓我們看看五個不同的克隆方法您可以使用構造。在本文的結尾,您可以為每個方法找到推薦的協議。

限製性內切酶結紮

長期以來被認為是傳統的克隆方法,限製結紮克隆允許感興趣的一個DNA片段插入一個向量通過“剪切和粘貼”過程。這個便宜的,靈活的方法可以分解成一個基本的、兩步的過程。

重要的是要注意,限製結紮的局限性,尤其是在選擇限製性內切酶切割網站(s)。此外,明智的選擇緩衝至關重要,因為並不是所有的限製性內切酶同樣工作在所有緩衝區。此外,即使你按照協議,限製結紮並不是一個完美的過程,有時會失敗。這裏有一些技巧來避免這個問題盡可能多的。

網關克隆

這克隆方法是商業成立於1990年代末的主要優勢是一個複合反應動作一塊從一個質粒DNA到另一個。這簡化了過程,減少了時間限製結紮克隆。雖然克隆過程可以在90分鍾內完成,重要的是要注意,可以及時的初始設置。

執行網關克隆感興趣的,你必須先準備你的DNA片段通過周圍特定的複合網站(也稱為網關重組網站;丙氨酸序列)。因此,您必須首先克隆你的DNA片段“捐贈質粒”。這可以通過傳統的克隆方法或使用威尼斯平底漁船克隆或網關BP Clonase反應。克隆產生的質粒被稱為一個條目。

一旦DNA片段克隆一個條目,它可以迅速穿梭到任何兼容的網關目標向量。因此,您可以您感興趣的基因克隆一次通過限製性內切酶克隆,然後使用細菌重組容易轉移到一係列的質粒。這個方法是非常有用的對於許多DNA片段轉移到一個類型的質粒或成許多不同類型的質粒。

雖然需要使用特定的質粒,該方法普遍為所有類型的DNA片段,並有超過90%的準確率。

吉布森組裝

的吉布森組裝方法相比,通常SLIC,是許多DNA片段的過程都添加到構建在一個試管反應,生產克隆沒有任何疤痕。可以組合多個零件同時靈活的序列設計,並引入啟動子的能力,終端和其他短序列組裝。大會是在2小時內完成。

吉布森裝配不依賴於限製性位點的存在在一個特定的序列合成或克隆,所以你有完全控製組裝。你也避免不必要的額外的序列的包容,這通常是用來促進多個DNA序列的克隆。因此,更多的DNA片段可以加入一個反應和更高的效率比傳統的方法。然而,注意:有成功率大幅減少當組裝超過5片段。此外,由於聚合酶和連接酶利用克隆反應期間,吉布森大會由於核苷酸mis-incorporations序列可能導致錯誤。作為一種替代方法,在融合克隆用ligation-free技術最大限度地減少這些錯誤。在融合工具來從PCR一體化解決方案,淨化、克隆,細胞轉變。

金門組裝

金門組裝使用兩個類型IIS限製性內切酶,削減實際識別網站之外的DNA的酶。識別網站由至少一個堿基對序列過剩,確保沒有疤痕的DNA序列,因為過剩的序列不是由限製性內切酶。如果識別序列不是回文,可以組裝多個片段在同一時間並以有序的方式。此外,由於限製網站改變反應期間,消化和結紮可以發生在一個管,在同一時間。因此,這種方法通常被認為是一個“一鍋奇跡。”

金門結紮過程效率接近100%由於re-digestion機製。同時,re-ligation阻止,因為裂開以外的限製性內切酶網站從產品中刪除它們。然而,你可能會發現,設計正確的過剩序列可以是乏味的,和金門裝配序列獨立比其他克隆方法要少得多。盡管有這些限製金門大會特別有利於構建組合庫的每個片段都是在相同的兩個突出部分序列。

威尼斯平底漁船(TA)克隆

威尼斯平底漁船克隆我使用一個單一的酶,拓撲異構酶(TI)放鬆和結紮DNA。TI用於複製的自然過程;打開/解除的DNA產生進一步上遊的壓力,為了緩解這個壓力,防止破損TI與DNA結合,開辟並打開它,然後再次加入尼克剛剛創建。

TI是非常有效的;你可以完成一個反應在室溫下,隻需5分鍾,你不需要使用限製性內切酶和連接酶。現場留下的TI裂解出感興趣的一個密封的DNA片段插入到向量。盡管快速反應時間,你可能會花一些時間與初始準備特定的引物是必要的。此外,威尼斯平底漁船克隆的效率取決於所使用的聚合酶。

接下來是什麼?

克隆繼續成為可能的結構和功能基因的研究和其他重要從即使是最複雜的基因組DNA序列。

進一步簡化克隆過程等項目都是免費的基因組的編譯器讓生物學家設計克隆的DNA結構通過毫不費力地模擬一些本文中描述的方法。基因組等軟件編譯器從設計節省時間通過消除錯誤,並允許用戶方便地插入或引物直接通過設計軟件平台。

克隆技術不斷提高,成為更簡單、更便宜。一定要熬夜這些技術最有效的設計和合成你的DNA。

建議的協議列表
限製結紮	傳統的克隆
	限製消化協議
	與質粒DNA克隆向量
	克隆技術指南
吉布森組裝	吉布森裝配協議
	協議從本質
	協議從塞繆爾·米勒實驗室,西雅圖華盛頓大學
金門組裝	金門組裝
	金門裝配協議
	金門大會解釋
網關克隆	克隆網關協議
	Untergasser克隆的實驗室網關協議
	網關克隆:克勞夫實驗室版
威尼斯平底漁船克隆	威尼斯平底漁船TA克隆協議
	Untergasser的實驗室威尼斯平底漁船克隆協議
	理發師實驗室克隆與威尼斯平底漁船TA克隆工具