如何使脂質影響嗎

支持脂質影響是一個非常有用的工具在許多領域的細胞和生物膜。但它有多容易讓他們嗎?

影響可以很反複,一旦你找到了一個可靠的協議!然而,它可以花些時間來優化你的技術,所以增加你的機會,確保你讀文獻在開始之前。

這個協議,我覺得非常有用的描述方法研究T細胞免疫突觸的影響¹,但原則也適用於其他應用程序。

選擇你的雙分子層構成

當設置使影響的第一步是決定脂質成分。取決於您的應用程序,你的脂質成分各有不同,但大多數影響將主要含有磷脂酰膽堿(PC),它提供了結構框架。

你可以用聚乙二醇(PEG)緩衝改善雙分子層的均勻性,減少蛋白質聚合。要做到這一點,包括一小部分脂質與脂質headgroups PEG5,000聚合物共價結合。然而,請注意,過多的掛鉤會妥協你的雙分子層的流動性。

您可以使用不同的策略來連接蛋白的影響;兩個最常見的是通過Ni-NTA脂質(綁定His-tagged蛋白質)和生物素化的脂質(鏈黴親和素結合,進而捕獲與生物素標記的蛋白質)。

創建影響——這是一種魔法

下麵是一個表,它顯示了一個示例的一個典型的脂質混合物DOPC (2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)為主要結構部件,DGS-NTA (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3 - [N - (5-amino-1-carboxypentyl)亞氨基二乙酸丁二酰)(銨鹽))為綁定His-tagged蛋白質,塗料(2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)附加鏈黴親和素生物素,和PEG5,000-DOPE改善雙分子層的均勻性。脂類被添加在特定的摩爾百分比。從脂質濃度和分子量,可以計算得到所需的卷製成凍幹脂質混合所需的最終濃度(例如1毫克/毫升)。

一旦你有單獨的脂質(存儲在氯仿),把它們混合在一個玻璃小瓶,然後允許混合物在一夜之間蒸發。這導致脂質床單被沉積在玻璃管的底部——這被稱為脂質蛋糕。你會看到,它看起來像一個白色的存款的瓶。

再水化1毫升的PBS的蛋糕,渦30秒,蛋糕會膨脹並形成大囊泡的大小變化。接下來,擠壓脂質混合物通過一個聚碳酸酯過濾幾次,這一過程被稱為“擠壓”,生成一個同質的解決方案所需的脂質體(小脂質囊泡)的大小(通常50 - 100海裏,是由過濾器)的大小。冰箱裏儲存脂質體長達兩周。

在下一步中,當你把這些脂質體在一個幹淨的玻璃蓋玻片在適當的濃度和正確的鹽濃度(例如5毫米Ca^{2 +}),他們會自發地爆炸,形成一個保險絲支持脂質雙分子層。

它就像魔法!

在這一步中,玻璃蓋玻片的準備是非常重要的——玻璃需要清潔,幹燥和疏水性。否則,影響可能不均勻或囊泡可以積累在表麵沒有破裂和合並形成了雙分子層。

這一步我有一些問題,但是在聯係研究員在美國,我能夠提升雙分子層流動通過調整清洗過程。我清潔我的幻燈片添加10 m氫氧化鈉15分鍾,然後70%乙醇5分鍾,其次是用MilliQ水徹底衝洗。然後我使用氮氣流幹的幻燈片。

清洗後,您可以直接吸管脂質在幻燈片確保覆蓋整個表麵,然後離開30分鍾。這允許足夠的時間的影響。之後,用大量的PBS徹底衝洗去除多餘未溶化的囊泡的表麵。

你的影響移動嗎?

移動影響很重要,這樣你的脂質和蛋白質可以分散以同樣的方式,因為他們將在實際的細胞膜。檢查你的流動影響,使用顯微鏡技術光漂白後熒光恢複(捆牢)²,這依賴於熒光標記分子的擴散到photobleached樣本區域。^。你應該檢查你的流動脂質(通過向其脂質,如rhodamine-tagged脂質)和附加的流動性蛋白質(通過使用熒光蛋白質鏈黴親和素或fluorescently-labelled)。

你在業務…

總之,影響學習,一個很酷的工具和信息交互或膜蛋白動力學簡化的係統,您可以控製。我的工作影響了我展示T細胞能夠發送一個激活信號從細胞外到細胞內信號通路。

也許影響可以幫助你!

引用

1. Beemiller P等。2012。成像和分析OT1細胞活化脂質影響。Protoc。Exch。doi: 10.1038 / protex.2012.028
2. 阿克塞爾羅德D出版社。1976年。移動性測量分析的熒光光漂白恢複動力學。Biophys。J。16:1055 - 69。