維生素H和蛋清:免疫組化用鏈黴親和素生物素
如果你想讓分子粘在一起，你需要了解鏈黴親和素/生物素。本文繼承了Mike的文章免疫組化的“三明治”和“擴增”方法(IHC)，包括鏈黴親和素-生物素在IHC中的工作原理，包括協議。
Streptavidin-Biotin
它是什麼?
抗生物素蛋白是一種天然的生物素結合蛋白，存在於蛋白中。
鏈黴親和素類似於親和素，但它是由一些鏈黴菌屬用於抑製競爭細菌的生長。
生物素維生素b是一種小分子維生素b(維生素B7)，也被稱為維生素H(或輔酶R)。“H”代表“Haar und Haut”——德語中頭發和皮膚的意思，因為它有助於皮膚、頭發和指甲的健康。
它能做什麼?
鏈黴親和素和親和素對生物素具有極高的親和力。然而，鏈黴親和素通常比親和素更受青睞，因為它對生物素具有非常高的特異性。階梯親和素結合強，通過大量的氫鍵。強到這個鍵幾乎和共價鍵一樣強。
鏈黴親和素/生物素反應因其強烈、特異性而具有吸引力。大量的生物素分子可以偶聯到單個感興趣的蛋白質/抗體上。因此，生物素可以作為一種非常特殊的免疫組化擴增技術。
鏈黴親和素-生物素在免疫組化中的曆史
鏈黴親和素生物素在20世紀70年代首次被用於研究。1979年，巴斯德研究所的一個研究小組發表了一篇論文，其中描述了用生物素標記抗體和抗原的生物素。包括證明該技術在定量免疫檢測和免疫組化(1)．1981年，一篇關於親和素-生物素-過氧化物酶複合物(ABC)的論文發表，該複合物至今仍被廣泛使用(2)．在這篇論文中，研究團隊開發了一種新的方法，用於福爾馬林固定的石蠟包埋組織，包括二級抗體的生物素標記和隨後的ABC添加。在這裏，生物素化的二抗在一級檢測抗體和親和素/生物素複合體之間形成了一個鏈接。
1977年，Vector實驗室推出了第一批商用親和素(或鏈黴親和素)-生物素複合物之一。他們還幫助開發ABC係統並獲得專利，隨後將這些係統商業化提供給研究界。不久之後，其他公司也開始提供類似的商業產品。與過氧化物酶一樣，親和素-鏈黴親和素可以與熒光蛋白等配體共價連接，從而使生物和免疫組化應用範圍更廣。例如，分子探針(生命技術)生產鏈黴親和素結合到Alexa Fluor熒光探針上提供了從346 nm到749 nm的激發光譜範圍。
知道你的極限
但是ABC方法也有局限性。最重要的是，內源性生物素可以在組織中找到，特別是在肝髒、脾髒和腎髒中。與福爾馬林固定的石蠟包埋組織相比，這種內源性生物素在冷凍組織切片中表達最高。此外，盡管抗原檢索技術對揭示抗原有用，但檢索技術也可以增加內源性生物素的可用性，導致高背景染色。使用親和素-生物素複合物的另一個問題是，親和素是一個相對較大的分子，這可能會阻礙其滲透到組織中。
例子的協議
下麵是阻斷內源性生物素的方法，以及鏈黴親和素-生物素免疫組化方法的一個例子。
生物素阻止協議
生物素阻斷應在正常血清阻斷後和與相關一抗孵育前進行。您可以使用此協議或眾多可用的商業套件之一進行阻塞。
材料
- 洗滌緩衝液(PBS或TBS)
- 生物素(在洗滌液中加入0.01%)
- 鏈黴親和素或親和素(在洗滌液中加入0.05%)
方法
- 用鏈黴親和素/親和素溶液孵育切片20分鍾。這一步驟將阻斷組織中的內源性生物素
- 在洗滌緩衝液中洗滌。這一步很重要。如果錯過，那麼與組織結合的鏈黴親和素/親和素(第1步)也會與免疫組化方法中使用的生物素標記抗體/探針結合。
- 用生物素溶液孵育切片20分鍾。這一步驟將使遊離親和素/鏈黴親和素的所有可用生物素結合位點飽和。
- 在洗滌緩衝液中洗滌。
- 繼續使用一抗。
Streptavidin-Biotin包含IHC協議
- 脫蠟並給載玻片補水。看到H&E文章了解詳情．
- 執行抗原檢索如果有必要的話)。
- 塊用與正常血清相同的種作為二抗。
- 必要時可采用生物素阻斷法。
- 添加所需時間的主抗體。
- 在洗滌液中洗滌三次。
- 進行過氧化物酶阻斷。在3% H溶液中孵育切片20分鍾2O2在PBS。
- 在洗滌液中洗滌三次。
- 加入生物素化二抗(在PBS中)至少30分鍾。
- 在洗滌液中洗滌三次。
- 加入ABC過氧化物酶檢測溶液30分鍾(注意-這些通常是試劑盒形式，如試劑盒可從熱科學皮爾斯和向量的實驗室．
- 在洗滌液中洗滌三次。
- 在過氧化物酶底物DAB(3,3 ' -二氨基聯苯胺)中孵育切片。這通常以套件的形式出現，例如從Abcam或向量的實驗室。
- 在洗滌液中洗滌三次。
- 如果需要複染色。
- 通過酒精脫水，生成二甲苯。
- 添加蓋玻片/安裝介質。
這就是如何做到的!希望這能讓你開始在免疫組化中使用鏈黴親和素生物素。盡管它也可以用於其他各種技術，包括Western Blots和elisa。
參考文獻
- Guesdon等．(1979)親和素-生物素相互作用在免疫酶促技術中的應用．J Histochem Cytochem27:1131-9。
- 許等．(1981)親和素-生物素-過氧化物酶複合物(ABC)在免疫過氧化物酶技術中的應用．J Histochem Cytochem29:577 - 580。