成功克隆網關的關鍵因素
目前流行的一種高效克隆係統是英傑公司的Gateway®克隆技術。Gateway克隆使研究人員有機會利用稱為Gateway att位點的專有重組位點和LR克隆酶或BP克隆酶混合酶，輕鬆地將DNA片段轉移到質粒中。
網關克隆是有效的，允許您克隆不使用限製性內切酶或連接反應，但它仍然有多個步驟可以優化。我在下麵描述了網關克隆係統的概述，以及將提高克隆效率的一些因素．
網關克隆如何工作
在我們為您提供一些成功克隆Gateway載體的頂級技巧之前，讓我們回顧一下這項技術是如何工作的。
這種克隆方法使用了位點特異性重組。這些特定的位點被稱為att位點，它們是整合酶的目標。有四個不同的att位點:attB、attP、attL和attR。
這些位點成對地一起工作，通過使用特定的酶混合物，讓你感興趣的基因在質粒之間移動:
- attB和attP結合在一起，當與BP克隆酶結合時，酶Mix將重組為attL和attR位點。
- 當attL和attR位點配對並與LR克隆酶Mix結合時，將重組為attB和attP位點。
首先，創建帶有attB位點的PCR產物，然後將其與含有attP位點和BP克隆酶的供體載體結合。重組的結果是形成一個包含您感興趣基因的入口載體(圖1)。供體載體包含有毒的ccdB基因，在成功重組後被您感興趣的基因所取代，這意味著轉化後產生的所有克隆都包含有您感興趣基因的入口載體。
使用您的入口向量，您可以將您感興趣的基因轉移到目標向量(例如，創建一個用於您的實驗的表達向量)。這使用了類似的反應，但由於最初的att位點現在是attL和attR位點，所以使用了LR克隆酶混合(圖2)。
理解酶反應
BP克隆酶混合酶包含整合酶和輔助因子蛋白，整合宿主因子(整合宿主因子，IHF)催化attB和attP位點的重組。
LR克隆酶Mix含有整合酶和IHF，也含有切除酶(Xis)。而Xis酶的作用則導致atl和attR位點的重組。
利用網關技術克隆的優點
與傳統的克隆方法相比，使用這種技術有許多優點:
- att序列不是回文序列，這意味著插入是有方向性的。
- 入口載體可以用於將感興趣的基因放置到一係列不同的表達係統中，而無需進行任何設計上的改變。
- 有一係列Gateway表達載體，可在不同係統(如大腸杆菌，哺乳動物細胞，酵母)或特定應用(如抗體生產，蛋白表達)中表達。
- 不包含感興趣基因的載體反而包含ccdb基因，這允許“空”載體的負選擇。
一步一步指南克隆與網關係統
第一步:將你感興趣的DNA插入門戶入口向量
有兩種不同的方法可以插入你的DNA片段，你用你的DNA提取協議，進入入口克隆。
1.D-TOPO克隆
感興趣的DNA +帶有attL位點的進入向量(pENTR) =進入克隆
在這個方法中，您使用PCR來放大你感興趣的片段並添加一些堿基，將片段定向克隆到入口向量中。簡單的設計你的前進底漆在你感興趣的DNA序列之前引入一個CACC序列。入口向量上的GTGG懸挑補充了5 ' CACC序列，並確保PCR產物以正確的方向插入以產生入口克隆。
在進行連接之前，將PCR產物與進入載體和鹽溶液在室溫下孵育，然後將反應轉化為有效反應大腸杆菌細胞。
2.BP Clonase反應
atb Sites + pDONR載體+ BP Clonase Enzyme Mix =進入克隆attL網站
在這種方法中，你可以設計引物來擴增你感興趣的片段，並在PCR產物的任意一側添加att B位點。然後，與pDONR載體和BP克隆酶混合在室溫下孵育PCR產物(你感興趣的DNA兩側有att B位點)一小時。最後，在轉化為感受態細胞前，在37°C下加入蛋白酶10分鍾，終止反應。
使用D-TOPO或BP克隆酶反應的選擇純粹取決於您的個人偏好或您的實驗室偏好。這兩種程序所花費的時間幾乎相同。
第二步:克隆你的基因到網關目的地載體
入口克隆+帶有attR位點的目標載體(pDEST) + LR克隆酶混合=克隆表達
第二步與BP反應非常相似:你用LR克隆酶混合酶在室溫下孵育你的入口克隆和目標載體(pDEST)一小時。然後加入蛋白酶終止反應，37°C孵育10分鍾，然後轉化為勝任態大腸杆菌細胞。
提高克隆效率的因素
以下因素將有助於提高您的克隆反應效率:
- 一定要使用純化的PCR產物。你可以用凝膠提取你的DNA或直接用PCR清洗。
- 可以將D-TOPO克隆反應的孵育時間從5分鍾延長到25-30分鍾，以達到最佳效果。
- LR Clonase協議要求您添加50-150 ng的入口克隆到150 ng的pDEST。但是，它總是有助於使用1:1的入口克隆到目標向量。例如，對於150 ng的pDEST，使用150 ng的條目克隆。如果你沒有足夠的後DNA提取，兩者均使用100ng。
- 為了節省成本，可以使用1µl的克隆酶混合液，而不是方案中規定的2µl。在這種情況下，越少越好!
- 確保你沒有混合BP和LR克隆酶混合。前者應該用於生成條目克隆，而後者總是用於構造表達式克隆。
- 如果你的最終表達克隆將超過10kb，它有助於將LR克隆酶反應時間從1小時延長到2-3小時;你也可以把它延長到一晚上，雖然這並不總是必要的。
- 確保檢查兩次，你使用的向量與正確的att位點為你的反應。
當我把這些步驟添加到我的克隆協議中時，我就更成功了。希望你也會發現它們有用。
網關克隆快樂!
最初發布於2016年9月20日。Revie結婚並於2021年9月更新．