如何製作自己具有化學能力的細胞

我曾經經曆過無法運行測定的可怕經曆，因為我用完了化學轉型的庫存大腸杆菌（（大腸杆菌）。從那天起，我學會了在實驗室中製作自己的化學勝任細胞。

我建議每個人都出於三個簡單的原因而製作自己的化學勝任細胞。首先，每個分子生物學家都應該學習如何做。其次，它非常簡單。第三，它將為您節省金錢並防止緊急情況。

今天，我將告訴您如何製作DIY的化學能力庫存大腸杆菌，分子生物學實驗室中的主力。

您需要的東西

1. 任何新的過夜文化大腸杆菌在LB肉湯中生長的菌株。
2. 無菌離心管（例如，用於Beckman JA-17轉子）。獵鷹管也很好。
3. 用於閱讀光密度的光譜儀大腸杆菌。
4. 無菌，冰冷的CACL₂在100毫米處。
5. 無菌，冰冷的CACL₂在100毫米處為15％V/V甘油。
6. 無菌Eppendorf管。

什麼是化學勝任的細胞？

化學勝任的細胞基本上是已接受化學物質治療的細菌，可以使蟲子在情況所需時服用質粒DNA（您的實驗）。

將質粒進入錯誤的過程稱為轉化，化學能力的細胞通過熱休克。

以及你怎麼做大腸杆菌很高興接受外國質粒嗎？您會發現，這些小錯誤通常不會出於無緣無故地吞噬任何異物（包括質粒）。訣竅是破壞（激活）該細胞膜大腸杆菌因此，質粒將能夠在細胞中移動。

能夠接受外源DNA的狀態稱為能力（圖1）。

要準備化學勝任的細胞，您需要生長一批大腸杆菌從少量和亞文化中。然後，收集大腸杆菌當它們積極分裂時（在對數增長過程中）。由於人口在對數增長過程中是同步的大腸杆菌最好準備成為轉型能力。

因此，在對數期生長過程中收集細胞至關重要。

還，當製作一批化學勝任時大腸杆菌，我們不會在生長培養基中添加任何抗生素。這是因為我們沒有放大任何質粒，這是賦予抗生素耐藥性的大腸杆菌實驗室中的細胞。因此，請注意無菌技術，以免在製備過程中汙染細胞。

收集後，用一係列冷的鹹緩衝液洗滌小蟲子，使膜半滲透到質粒DNA。

將細胞等分，將它們冷凍在-80°C，嘿，普雷斯托！您自己的一批化學勝任細胞。

DIY勝任的單元協議

這是一個簡單的逐步協議，可讓您在實驗室中準備自己具有化學勝任的細胞：[1]

1. 去準備下麵的所有表1，然後將其全部放在冰箱中。
   
2. 與您想要的無純無菌磅大腸杆菌拉緊。在37°C下過夜，以200 rpm搖動。
   
3. 將1 ml的過夜培養物重新注入99毫升無菌lb，並在37°C下以200 rpm搖動，直到600 nm處的光密度（OD）₆₀₀達到0.3 - 0.5（中對數階段）。
   
4. 在無菌離心管之間平均分配100 mL培養物，並在4°C下以〜7000 rpm的速度離心10分鍾來收集細胞。丟棄上清液，並使用P200移液器去除剩下的所有滴劑。
   
5. 加入20毫升無菌，冰冷100毫米CaCl₂到每個細胞顆粒和輕輕重懸於細胞。讓重懸的細胞在冰上冷卻約15分鍾。
   
6. 通過在4°C下以〜7000 rpm的速度離心10分鍾，然後丟棄上清液。
   
7. 加入5毫升無菌，冰冷100毫米CaCl₂為每個細胞顆粒補充15％V/V甘油，並輕輕重懸於他們。
   
8. 將重懸的細胞分為無菌的冰質eppendorf管中的50μl等分試樣。
   
9. 將化學能力的細胞存儲在-80°C下。他們應該保持至少1年的能力。
   
10. 通過以已知量（例如1 µL的10 - 50 ng/µl）轉換化學勝任細胞的轉化效率包含陽性選擇標記的質粒並計算轉化菌落的數量。

表格1。準備化學勝任細胞的解決方案。

組件→	1 M CaCl2	100毫米CaCl2	100毫米CaCl215％V/V甘油
無水CaCl2	11.1 g	-	-
1 M CaCl2	-	10毫升	12毫升
甘油	-	-	18毫升
水	100毫升	90毫升	90毫升

在開始之前...

我們都知道，清晰的協議並不總是轉化為簡單的工作流程，並且內幕智慧也很長。這是一些有用的指針：

• 重要的是輕輕處理細胞因為我們正在削弱細胞膜以使其具有化學能力。這使他們容易受到身體傷害的影響，而死亡錯誤是無用的錯誤。
• 無菌，無菌，無菌。請記住，文化中沒有抗生素，因此容易受到汙染。檢查OD時要特別注意₆₀₀細胞並將培養物吸入Bunsen燃燒器。
• 如果您要為整個實驗室組構成勝任的單元格，並計劃填充（說）整個盒子，然後裝滿等分試樣，那麼標記所有管子雖然您的亞文化正在增長。然後將它們放入-80°C的冰箱中以冷卻。
• 另外，抓住一個實驗室夥伴和一些液氮在將細胞等分放在存儲之前，在寬闊的露珠中。你們中的一個可以將細胞等分為Eppendorf管，另一個可以關閉蓋子並將其放入液氮中以冷卻。請記住，快速而寒冷。

我真的很喜歡DIY運動準備實驗室試劑。誠然，我們很幸運能在這個時代進行科學，因為有很多“套件”可用。但是，學習如何在沒有他們的情況下生存總是一件好事。在緊急情況下，這些秘密的“個人股票”可以支付巨大的股息。

另外，在財務緊縮期間，DIY路線始終是預算友好且有用的。那麼為什麼不嚐試製作自己的電動電池也是嗎？

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最初發布於2016年8月。審查並更新了2021年11月。

參考

1. Chang a等。（2017）製備鈣勝任大腸杆菌和熱震轉化的製備。JEMI方法1：22–25