SAGE第二部分:LongSAGE, RL-SAGE和SuperSAGEgydF4y2Ba
聖人,或者gydF4y2Ba年代gydF4y2BaerialgydF4y2Ba一個gydF4y2Ba分析的gydF4y2BaggydF4y2Ba烯gydF4y2BaegydF4y2Ba表達，是一種技術，使您能夠數字分析一個細胞的整個基因表達譜。在這項技術之前，科學家們被限製在一次研究幾個基因的表達gydF4y2Ba表達序列標記方法gydF4y2Ba．SAGE最酷的部分是你甚至不需要測序你想要分析的基因:這項技術給你表達基因的身份和它們的表達水平，這個過程被稱為轉錄組分析。我複習了基本的細節gydF4y2BaSAGE技術gydF4y2Ba之前。在本文中，我將深入討論新的和改進的SAGE技術。gydF4y2Ba
SAGE步驟快速概述gydF4y2Ba
這裏有兩個主要原則。首先，一個9-10個堿基對的短核苷酸標簽可以用來唯一識別一個轉錄本。前提是它與文本中的唯一位置隔離。其次，將這些標簽串聯起來，可以同時研究多個基因的表達。然而，正如我們將看到的，第一點現在已經變得不那麼重要了。gydF4y2Ba
SAGE首先提取mRNA並將其逆轉錄生成cDNA。得到的cDNA經過一係列步驟處理。它的最終結果是串聯體的解。這些串聯體轉化為細菌細胞。隨著細胞的複製，產生越來越多的串聯體。或者，也可以使用PCR。無論哪種方法，材料都被提取出來，並用於創建基因表達譜圖。gydF4y2Ba
因此，SAGE技術使您能夠可視化哪些基因正在被表達，並可以幫助預測一個人可能罹患的疾病，幫助發現新基因，並幫助了解更多關於細胞表達譜的信息。gydF4y2Ba
除了聖人gydF4y2Ba
自從SAGE在20多年前首次被描述以來，已經出現了幾種變體。在這裏，我們將看看其中的三個:LongSAGE, robot - long - sage和SuperSAGE。每一個都是最後一個的改進。主要的區別在於吞吐量率。在他們的gydF4y2Ba1995年《科學》上的論文，VelculescugydF4y2Ba及其同事得出結論，他們的SAGE技術將需要幾個月的時間來確定每個細胞表達超過100個mrna的轉錄本(0.025%)。在當時，這種速度是不可思議的，但隨著時間的推移，這種速度實在是太慢了，促使人們開發出更快的技術形式。gydF4y2Ba
LongSAGEgydF4y2Ba
原始的SAGE技術可以用5gydF4y2Ba數百個cDNA文庫gydF4y2Ba標簽。相比之下,gydF4y2BaLongSAGE出版於2002年gydF4y2Ba自然生物技術gydF4y2Ba，gydF4y2Ba可以使用20 ?g的mRNA創建一個包含數千個cDNA標簽的文庫。gydF4y2Ba
在LongSAGE中，19-21堿基對標記用於創建連接體。由於基因片段較長(而不是原始SAGE方法中的9-10個堿基對標記)，它們在一個人類基因組大小的基因組中出現一次的幾率由>組計算為99.8%。這種準確性的提高以及對更大片段的研究能力將SAGE提升到了一個新的水平。gydF4y2Ba
這種技術的缺點是需要多種限製性內切酶。並不是所有的基因都有一種酶的限製位點，所以這項技術需要在幾種酶上重複。克隆和純化也存在技術問題，使得該技術的可靠性不穩定。這表明需要進一步改進。gydF4y2Ba
健壯的LongSAGEgydF4y2Ba
健壯的LongSAGE或RL-SAGE是SAGE的下一個迭代。描述它的論文發表於gydF4y2Ba2004年gydF4y2Ba植物生理學gydF4y2Ba．在這裏，Gowda等人描述了與LongSAGE相比的四個主要改進領域:gydF4y2Ba
- 它需要少量的mRNA來建立文庫:50 ng。gydF4y2Ba
- 他們使用增強的cDNA適配器和使用更長的結紮期(一夜)形成ditag。gydF4y2Ba
- 隻需要20個聚合酶鏈反應就可以獲得一個完整的文庫(與原始協議相比減少了90%)。gydF4y2Ba
- 在克隆到載體之前，連接體隻需要用限製性內切酶部分消化，這大大提高了克隆效率。gydF4y2Ba
這些改進意味著您可以在一個月內生成兩到三個庫，每個庫包含超過450萬個標記!但科學家們想進一步削減。而且，像Long-SAGE和SAGE一樣，RL-SAGE利用粘性的末端來形成ditags。這導致了一些偏差，因為關聯不是隨機的。gydF4y2Ba
SuperSAGEgydF4y2Ba
SuperSAGE在gydF4y2BaPNASgydF4y2Ba2003年gydF4y2Ba在加速過程和提高可靠性方麵又邁進了一步。這裏創建了26個bp標記。標簽長度的增加意味著更高的精確度(精確度是LongSAGE的10000倍左右)，因此存在兩個重複基因的可能性幾乎是不可能的。這裏的關鍵是新的限製性內切酶:噬菌體P1的iii型內切酶EcoP15I。這就產生了鈍端而不是粘端，從而確保了兩個標簽的隨機關聯以形成ditags。gydF4y2Ba
準確性和速度的提高意味著感染細胞和其他相互作用的有機體情況可以同時進行研究，而不必擔心混淆結果。此外，還可以發現序列的同工型。gydF4y2Ba
這項技術啟發了另一種變化:高通量(HT) SuperSAGE，其中下一代測序(NGS)被用於一次分析多達數百萬個標簽!隨著台式NGS的引入，HT SuperSAGE正在幫助解開科學上的一些重大問題，比如病毒如何影響其宿主細胞的轉錄組譜，以及如何在各個物種中發現新的基因。gydF4y2Ba
你試過這些技巧嗎?你的實驗室用SAGE做什麼?gydF4y2Ba