電子顯微鏡的冰凍和化學固定

發布於2019年4月23日

標本準備是最重要的方麵生物電子顯微鏡（em），因為它影響了從保存樣本本身到可以獲得的信息的所有事物。選擇正確的電子顯微鏡固定方法至關重要。

要選擇正確的固定技術，在開始電子顯微鏡項目之前，定義您要提出的問題的問題至關重要。

這使您能夠進行假設驅動的研究，這不僅可以節省很多錢，而且還可以使您能夠更快地獲得有意義的結果。簡而言之，您應該為樣本類型和要問的問題優化樣本準備。

任何生物EM樣品製備的第一步是固定。固定是通過隨後的加工和成像階段盡可能接近生命狀態的生物標本的所有代謝過程的方法。固定的主要類型有兩種：化學固定和冷凍固定。

化學固定

化學固定是生物EM的最受歡迎和最容易獲得的固定方法（圖1和2）。有幾種化學物質一旦應用於生物樣品，通常以共價鍵的形式在氨基酸，蛋白質和脂質之間形成交聯。

化學固定在保存形態方麵是較高的，用於凝結固定劑（例如溶劑和乙酸），通常用於光學顯微鏡。但是，化學固定也可能導致蛋白質變性，這在下遊抗體標記技術中可能是有問題的。使用時，這是一個挑戰相關光和電子顯微鏡（CLEM）。

有幾種被廣泛用於初始固定的化學物質，包括戊二醛，甲醛和丙烯醛。

戊二醛和丙烯醛會導致蛋白質的廣泛，快速和永久性交聯。可以將戊二醛用作唯一的固定劑。但是，它緩慢滲透到樣品中，在此期間，組織降解可能發生。因此，許多研究人員選擇將戊二醛與甲醛相結合（稱為卡諾夫斯基的固定裝置）。

甲醛快速穿透樣品，提供蛋白質的暫時交聯，隨後被戊二醛代替。

必須將固定劑應用於緩衝溶液中的樣品等滲固定劑的載體可防止細胞收縮或腫脹，從而使樣品盡可能地保持靠近生命狀態。這滲透性和滲透壓可以調整緩衝溶液以適合您的樣品。

經常采用次要固定步驟，尤其是用於TEM樣品製備。四氧化osmium是最常見的二級固定劑，它具有保存脂質膜的優勢，僅醛固定就不會保存脂質膜。它也充當汙漬，並為樣品提供了大量的對比度和電導率。

冰凍要求標本足夠快地冷凍以使水從其正常液態狀態冷卻到其固態（玻璃化）沒有中間冰晶相。冰的體積比液體形式大，這可能會導致生物超微結構的扭曲。

在形成冰晶期間，僅純水凍結，導致細胞內溶質的隔離和特征性的隔離偽像。有幾種方法可以實現水的玻璃化，包括冰凍冰凍，猛擊凍結或高壓凍結（圖1）。

雖然廣泛的標本適合冷凍，但隻有少量樣品會產生無定形（不含冰晶）冰，通常距離樣品邊緣小於100微米。這意味著，雖然可以將病毒，蛋白質，細胞器和細胞玻璃化，但由於其體積，因此很難獲得組織和多細胞生物的良好的冷凍固定。

冷凍電子顯微鏡（冷凍EM）涉及成像冷凍和水合的生物樣品，而無需汙漬或固定劑。冷凍EM通常是指透射電子顯微鏡（TEM），但冷凍階段（顯微鏡階段冷卻至溫度以下的溫度，通常使用液氮）可用於掃描電子顯微鏡（SEM）（圖2）。

盡管冷凍固定是快速（毫秒），並提供了對樣品的最佳保存，但是Cryo-EM具有挑戰性，並且需要專業設備才能準備，存儲，保留和圖像生物學樣品。此外，冷凍樣品很容易受到電子束損壞的影響。

低劑量成像狀態限製了擊中樣品的電子數量，從而減少損害在冷凍EM中很常見。但是，這些可能在最終圖像中具有低信噪比的缺點。通常需要數據處理以改善對比度。

即使您沒有冷凍階段或在顯微鏡上執行冷凍EM的能力，也可以使用CryoFixation修複樣品。樣品處理步驟與凍結替代後可以應用於化學固定後使用的樣品相同（見下文）。

固定後，需要樣品脫水。這是通過在水中使用梯度係列乙醇，甲醇或丙酮溶液來完成的，通常為30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，以及100％的幾種變化。您可以在-90處脫水冷凍樣品嗎？（（凍結替代）在非常高的溶劑濃度（95％或更高）中，其中一些可能包括汙漬，例如四氧化鹽以進行對比。

常規SEM的樣本通常是幹燥的，通常是通過臨界點幹燥，安裝在標本存根上，並塗有幾納米導電塗層（金，鉑/鈀或碳）。

對於tem和高級SEM技術，將樣品嵌入樹脂中，樹脂是一種粘性液體，可在幾個小時或幾天內浸潤樣品，並使用熱或紫外光聚合。該樹脂在切片過程中為樣品提供了支持（切成薄片的厚度為40-500 nm）。樣品要麼在進入顯微鏡之前或在顯微鏡內進行切片。

所有用於電子顯微鏡的化學物質和固定方法都是危險的，有些是極具毒性的。它們旨在殺死和保存細胞，您不希望它們在自己的組織附近。您必須使用適當的健康和安全設備，例如手套，眼部保護和煙霧罩進行化學程序。

所有化學品將提供安全數據表（SD）和風險和/或科什使用化學藥品之前必須進行評估。

無論如何電子顯微鏡實驗的應用，您選擇的固定方法對於獲得可靠的結果至關重要。在開始下一個EM實驗之前，請務必花時間優化樣本準備協議 - 您的未來自我將感謝您。

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寫的路易絲·休斯