NGS目標富集策略

下一代測序(NGS)開創了一個理解基因組內部運作和功能的新時代。NGS允許研究人員觀察與個體基因差異或突變相關的特征(包括疾病)。

由於隻有大約1%的人類基因組構成了編碼蛋白質的基因，因此已經開發了幾種策略來選擇性地豐富這些目標進行序列分析，以避免全基因組測序(WGS)，後者昂貴得多，並且不能提供對這些區域的一致覆蓋。目標富集策略是任何基因組學實驗室的關鍵組成部分，可以以WGS的一小部分成本收集遺傳數據，並具有更高的覆蓋深度。

靶標富集使得在單一測序分析中更容易識別單個基因、多個基因或整個外顯子組內的突變和其他變化。此外，富集策略有助於提高結果的準確性和可靠性。

降低了靶向NGS的成本，可以篩查個體的單核苷酸多態性(SNPs)和小突變，如插入和缺失(indels)。這在臨床研究隨著基因組分析進入臨床，它可能成為精準醫療的關鍵部分。

傳統技術

傳統的靶向測序方法主要有兩種:雜交捕獲探針和PCR擴增。

雜交首先需要建立一個測序庫，然後將精心設計的寡核苷酸誘餌添加到感興趣的區域。雜交文庫片段然後富集，通常使用鏈黴親和素/磁珠。成千上萬的魚餌在55到125個堿基對之間被使用。

第二種策略是通過設計高度複用的引物來擴增感興趣的區域。PCR後，從擴增子構建測序文庫。

一般來說，雜交試劑盒可以產生更均勻的測序覆蓋。PCR試劑盒有一個更簡單的工作流程，但可以顯示測序偏差(覆蓋範圍)更接近啟動位點。製造商為基因麵板、整個外顯子體和臨床靶標製造驗證套件。大多數公司也提供設計定製麵板的服務，盡管這個過程可能很昂貴，而且需要很長的交貨時間。

靶向NGS是一種流行且具有成本效益的方法，用於篩選個體的SNPs和indels，但還有其他類型的突變(結構變異)和遺傳現象(重複元件)不能用這些方法進行分析。有些問題可以用WGS解決;更好的方法是長讀取單分子WGS。假基因可以混淆靶向測序和WGS。這對臨床醫生來說仍然是一個挑戰，因為這些現象與許多疾病有關。

定向濃縮的新趨勢

在過去的幾年裏，隨著CRISPR/Cas9酶學的出現，基因組學界對基因編輯的興趣越來越大。通過這種方法，Cas9核酸內切酶可以被RNA分子引導到基因組上的同源DNA序列上，並在該位點上進行雙鏈切割——這就提供了一種可能性，即不需要的DNA序列可以被正常的DNA序列取代。

NGS技術人員開始使用同樣的方法進行目標富集。由於Cas9/guide RNA複合物可以在基因組的獨特位點上進行雙鏈切割，因此隻需幾個guide就可以豐富一個基因或基因組區域，而不是使用數百個誘餌或引物。這種有針對性的方法可以用來提供不能用傳統的目標濃縮方法收集的信息。使用短讀測序，可以獲得額外的側翼或內含子序列，偽基因可以很容易地解決。使用長讀方法，可以以WGS的一小部分成本解開基因組的結構變異、重複元件和“暗區”。